一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒制造技术

人乳头瘤病毒(HPV)是一种诱发外生殖器良性病变和女性子宫颈癌的主要病原体。HPV分为低危型和中高危型HPV。低危型HPV常引起外生殖器尖锐湿疣等良性病变；而中高危型HPV与宫颈癌及宫颈上皮内病变的发生密切相关。因此，有针对性地进行HPV的分型检测，对于宫颈癌的早期诊断和治疗具有一定的临床意义。本发明专利技术针对HPV基因组晚期区L1区设计特异引物和20型信号探针，将信号探针分别固定在印刷电路板金电极表面，制备成电化学传感器，用于捕获PCR多重扩增产物。由于信号探针标记有二茂铁分子，通过夹心杂交产生电流的变化，应用电化学基因传感器分析系统检测出电流值，最后进行人乳头瘤病毒基因型别判定。

【技术实现步骤摘要】
—种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒
本专利技术涉及一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20个基因分型的试剂盒，特别是涉及以一种电化学基因传感器技术快速分型检测20个人乳头瘤病毒型别的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本专利技术的试剂盒，实现对宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物样本中的20个人乳头瘤病毒型别进行快速检测和分析。
技术介绍
1998年底美国科学促进会将电化学基因传感器技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。生物芯片以其高通量、多靶位的检测模式正在被越来越多地应用于生物科学领域。以印刷电路板为载体的微阵列芯片，更以其高效、高通量、低价位等特点，已经广泛用于基础研究和临床筛查、辅助诊断。微阵列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗体芯片等，电化学基因传感器芯片以特殊化学方法处理后的印刷电路板为载体，将各种探针或靶标片段以化学键结合的方式固定在印刷电路板表面，并利用二茂铁衍生物作为电化学指示剂，形成可用于杂交反应或抗原抗体反应的微阵列芯片。宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国每年宫颈癌新发病例约13万，是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡的重要原因。近几年来，随着生活方式的改变，宫颈癌患者的发病年龄更趋年轻化，并且病例数有不断上升的趋势。宫颈癌也是目前唯一一种发病原因比较清楚的癌症，主要病因是由高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持续感染或反复感染所致，同一型别的高危HPV病毒持续感染导致发生宫颈癌或者宫颈病变的风险系数更高，而不同型别的HPV与宫颈癌的相关性也不一样，例如HPV16，18型感染与宫颈癌高度相关，60%以上的宫颈癌的发生是由HPV16，18型的持续感染所致；低危型如6，11等的持续感染则几乎不导致宫颈癌的发生。HPV主要通过性行为传播，也可通过接触污染物品传播。研究表明，几乎所有(99.7% )的宫颈癌患者中都有HPV的感染；有过性行为的女性，一生中至少感染过一种HPV的机率高达40%左右。只有高危型HPV的持续或反复感染才有致癌的可能，从HPV感染至宫颈癌发生需经历多年的时间，通过积极处理HPV感染及癌前病变，可以有效阻断病情发展，预防宫颈癌的发生。因此检测HPV基因型有助于判断病情的进展、制定个体化检查和治疗方案。目前确定的HPV型别约有100多种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别涉及生殖道感染，约20种与肿瘤相关。依据不同型HPV与癌发生的危险性高低分为低危险型HPV如HPV6，11，42，43，44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变；高危型HPV如16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59，68，73，82等15个型别与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN2 / 3)的发生相关，尤其是HPV16和18型；而26，53，66等疑似高危型别则可能会引起癌前病变，甚至宫颈癌。
技术实现思路
本专利技术涉及一种电化学基因传感器法分型检测20个人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒，特别是涉及以一种电化学基因传感器技术快速分型检测20个人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒。本试剂盒可以检测宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物样品中人乳头瘤病毒基因。 本专利技术适用于定性并分型检测宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物等临床样品中的 HPV16,18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，6，11 等 20 个人乳头瘤病毒型别。本专利技术的目的是提供一种使用电化学基因传感器技术来定性分型检测样品中20个人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒。其基本原理是利用四对寡核苷酸的特异性引物在UNG酶、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Mg2+和PCR反应缓冲液中，通过ABI2700、ABI9700等市售的定性PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，获得多重扩增产物；设计的特异性捕获探针分别固定在特制的印刷电路板金电极表面，制备成电化学传感器(芯片)，用于捕获PCR多重扩增产物；特异性信号探针与已捕获的PCR产物特异结合。由于信号探针标记有二茂铁分子，通过夹心杂交产生电流的变化，应用电化学基因传感器分析系统检测出电流值(信号值)，并对20个不同人乳头瘤病毒型别的碱基进行判定，从而达到快速检测靶多核苷酸的目的，用以指导临床治疗。本专利技术所提供的检测样品中人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒包括:(I)分别装有PCR扩增反应液、PCR扩增反应酶系、电化学杂交液、空白对照、人乳头瘤病毒阳性质控品和阴性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的37条引物包括:正向引物MYl 1-A:5’ -GCACAGGGACATAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:1)，正向引物MYll-B:5，-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:2),正向引物MYll-C:5’-GCACAGGGACATAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:3),正向引物MYll-D:5’ -GCCCAGGGCCACAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:4),正向引物MYll-E:5’-GCTCAGGGTTTAAACAATGG-3，(SEQ ID NO:5),正向引物MYll-F:5’ -GCACAAGGCCATAATAATGG(SEQ ID NO:6)，正向引物MYll-G:5’-GCCCAGGGTCATAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:7),正向引物MYll-H:5’-GCACAAGGTCATAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:8),正向引物MYll-1:5’ -GCICAGGGICATAAIAATGG-3’ (SEQ ID NO:9),[0021 ]正向引物 MYl 1-J:5’ -GCACAGGGACACAATAATGG-3’ (SEQ ID NO: 10)，反向引物MY09-1:5’ -AGGTAGATGAGGTGGTGGGT-3’ (SEQ ID NO:11),反向引物MY09-2:5’-ACGCAATCCAGCCTGAACCA-3’ (SEQ ID NO:12),反向引物MY09-3:5’-TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA-3’ (SEQ IDNO:13),反向引物MY09_4:5’-GACGATGTGCGGGTGGATGT-3’ (SEQ ID NO:14)，反向引物MY09-5:5’-GCATAGATGAAAAACAAACTGTA-3’ (SEQ ID NO:15)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒，该试剂盒包括：PCR扩增反应液、PCR扩增反应酶系、电化学杂交液、人乳头瘤病毒阳性质控品和阴性质控品。其中PCR扩增反应液由PCR反应缓冲液、镁离子溶液、能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第一条链结合的10条正向引物、能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第二条链结合的27条反向引物组成；PCR扩增反应酶系由Taq酶、UNG酶和dNTPs组成；电化学杂交液由杂交液I、杂交液II、杂交液III组成。

【技术特征摘要】
1.一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒，该试剂盒包括:PCR扩增反应液、PCR扩增反应酶系、电化学杂交液、人乳头瘤病毒阳性质控品和阴性质控品。其中PCR扩增反应液由PCR反应缓冲液、镁离子溶液、能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第一条链结合的10条正向引物、能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第二条链结合的27条反向引物组成；PCR扩增反应酶系由Taq酶、UNG酶和dNTPs组成；电化学杂交液由杂交液1、杂交液I1、杂交液III组成。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的10条正向引物和27条反向引物的序列包括:正向引物 MYl 1-A: GCACAGGGACATAACAATGG正向引物 MYl 1-B: GCGCAGGGCCACAATAATGG正向引物 MYl 1-C: GCACAGGGACATAATAATGG正向引物 MYl 1-D: GCCCAGGGCCACAACAATGG正向引物 MYl 1-E: GCTCAGGGTTTAAACAATGG正向引物 MYl 1-F: GCACAAGGCCATAATAATGG正向引物 MYl 1-G: GCCCAGGGTCATAACAATGG正向引物 MYl 1-H: GCACAAGGTCATAATAATGG正向引物 MYll-1:GCICAGGGICATAAIAATGG正向引物 MYl 1-J:GCACAGGGACACAATAATGG反向引物 MY09-1:AGGTAGATGAGGTGGTGGGT反向引物 MY09-2:ACGCAATCCAGCCTGAACCA反向引物 MY09-3:TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA反向引物 MY09-4:GACGATGTGCGGGTGGATGT反向引物 MY09-5:GCATAGATGAAAAACAAACTGTA反向引物 MY09-6:GCACACTTGAAAAATAAACTGTAA反向引物 MY09-7:TGGAAAATAAACTGCAAATCA反向引物 MY09-8:AGGTGGAAGCAGCAGGACGC反向引物 MY09-9:CCTATTCTTCACCATGCCTTA反向引物 MY09-10:CGATGATGCGGGGCGTTTTA反向引物 MY09-11:AGAGGATACAGGCGGTTTAG反向引物 MY09-12:AACACAAATTGTAATTCATATTCC反向引物 MY09-13:TTTGCGTTTGGTGGATGGTG反向引物 MY09-14:GGGTAGAGGTAGGGGCAGGC反向引物 MY09-15:TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC反向引物 MY09-16:GCAGTAGTTGCTGTGGCGGG反向引物 MY09-17:GGTAGCATCCATTGTGTGTAAA反向引物 MY09-18:CGAGGAAGCGGAAGAGGATG反向引物 MY09-19:TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC反向引物 MY09-20:GGGCTGTAGAGGGCTTAGAC反向引物 MY09-21:TGCGTCCCAAAGGAAACTGATC反向引物 MY09-22:CTACCTAAAGGAAACTGATC 反向引物 MY09-23:AACTTGCGACCCAATGCAAACTG 反向引物 MY09-24:CGTCCTAAAGGAAACTGGTC 反向引物 MY09-25:CGACCCAATGGAAACTGATC 反向引物 MY09-26:TTTACGGCCCAACGGAAACTGATC 反向引物 MY09-27:TGCGCCCTAAGGGAAACTGGGT。3.根据权利要求2所述的引物序列，其特征还在于正向引物工作浓度均为0.5i!mOl/L，反向引物的工作浓度均为0.03iimol / L04.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应酶系中Taq酶的浓度为7U /反应，UNG酶的浓度为0.1U /反应，dNTPs的浓度为0.6mmol / L。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华云，李明，肖湘文，黄桃生，赵丽，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：