一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用制造技术

本发明专利技术提供了一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用，本发明专利技术自泰山林地腐殖土中经人工富集、筛选得到一株，该菌株鉴定为草酸青霉菌（Penicillium?oxalicum），命名为草酸青霉菌C2，该菌株具有较好的纤维素降解能力，产纤维素酶活力高，摇瓶发酵3d后滤纸纤维素酶活力达到132.26U/mL；利用草酸青霉菌C2菌株制备的分生孢子菌剂应用于蚕沙堆肥中，能够提高堆体温度、延长高温期，有助于降低含水率，促进有机质的分解、全氮相对含量的增加，降低C/N比和提高种子发芽指数，加速堆肥进程，提高腐熟效率和肥料质量；菌剂的制备方法工艺简单，成本低，利于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用
本专利技术涉及一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用，属于微生物
。
技术介绍
纤维素是自然界中含量最丰富的一类可再生能源物质，广泛存在于农作物秸杆、畜禽粪便、城市生活垃圾和造纸厂废水中。据报道，全世界每年通过光合作用产生的纤维素约高达4.0X1010吨，其中农作物秸杆产量约为22亿多吨，我国作为农业大国，农作物秸杆资源非常丰富，每年可达6.5亿吨以上，占世界秸杆总产量的20%~30%。但是，由于纤维素分子的结构复杂，自然降解过程极其缓慢，目前我国的纤维素类资源利用效率很低，除少部分用于造纸、建筑、纺织等行业外，其余大部分被当做燃料直接焚烧，或被随意堆积、丢弃，不仅浪费了资源，更造成了环境污染和生态破坏。作为宝贵的可再生资源，纤维素的降解不仅在自然界的碳循环中起到重要作用，而且在很多方面都具有重要的潜在应用价值。研究表明，纤维素类物质可以被降解为葡萄糖，并进一步转化为生物燃料、菌体蛋白、优质饲料、食品等物质。因此，如果可以将这些农业废弃物大规模加以转化和充分利用，这不仅能缓解能源紧张问题，更能解决环境污染的难题。蚕沙作为我国蚕桑生产的主要副产物之一，产量巨大且含有丰富的营养物质，是一种具有良好开发应用前景的资源。在蚕沙资源利用的诸多领域中，蚕沙的堆肥处理是目前应用最广泛且经济有效的方法。但是由于蚕沙中含有大量难以降解的纤维素，单纯依赖蚕沙中微生物降解难以达到预期效果。因此，寻找和开发高效纤维素降解微生物，成为纤维素资源能否高效利用的关键。环境中的纤维素降解菌可以通过分泌纤维素酶有效降解纤维素且不会对环境造成污染，具有其他处理方式不可替代的优点，应用前景广阔。目前，从环境中分离和选育纤维素酶高产菌株，挖掘纤维素酶产生菌资源，利用微生物的酶解作用，解决环境污染甚至是转化为能源已经成为国内外的研究热点之一。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用，可用于蚕沙的堆肥腐熟。一株纤维素降解真菌，来源于泰山林地腐殖土，经人工富集、筛选得到。该菌株鉴定为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum),命名为草酸青霉菌C2,菌落平坦,结成外壳,菌丝初为白色后逐渐变为暗绿色，分生孢子梗顶端形成扫帚状的分枝，分生孢子椭圆形，光滑。一株草酸青霉(Penicillium oxalicum),已于2013年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC N0.8335。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所邮编100101。利用上述草酸青霉菌 C2生产的微生物菌剂，其活性成分为草酸青霉菌C2分生孢子及其产生的纤维素酶。所述的微生物菌剂为固体粉剂。草酸青霉菌C2分生孢子菌剂的制备方法，具体包括如下步骤:(I)种子液的制备:取PDA平板培养的草酸青霉菌C2菌株圆形菌块，接种液体PDA培养基中，30、V 200r/min振荡培养18h~20h作为纤维素降解菌C2种子液。(2)发酵培养:将种子液按照相对固体培养基质量分数5%的接种量接种到产孢子固体培养基上，在相对湿度60%~80%条件下，28°C培养4~6d，将培养物自然风干后粉碎过筛，即得到草酸青霉菌C2分生孢子菌剂。其中所述的培养基配方如下: PDA 培养基:马铃薯 200.0g, (NH4)2SO4L 0g，葡萄糖 20.0g，牛肉膏 5.0g,MgSO4L 0g, KH2PO40.6g，CaC033.0g,琼脂 15g (液体 PDA 培养基不加琼脂)，蒸馏水 1000mL ；产孢子固体培养基:麸皮40g，玉米粉 20g，蔗糖 5g，KNO3Ig, KH2PO40.5g,MgSO40.lg,蒸懼水300mL。所述的草酸青霉菌C2分生孢子菌剂中含草酸青霉菌C2的分生孢子数为(4.8~5.6) X IO8 个/g。本专利技术还提供了该草酸青霉菌在蚕沙堆肥中的应用，能够加速堆肥进程，提高腐熟效率和肥料质量。本专利技术具有以下优点:1.草酸青霉菌C2具有较好的纤维素降解能力，对滤纸条进行5d的降解处理后滤纸条溃烂成团糊状。2.该草酸青霉菌具有较好的产滤纸纤维素酶能力，液体发酵3d后滤纸纤维素酶活力达到132.26U/mL。3.该草酸青霉菌生长迅速、发酵性状优良。4.该种制备方法的发酵工艺简单、成本低，利于工业化生产。5.该草酸青霉菌应用到蚕沙堆肥中，能够加速堆肥进程，提高腐熟效率和肥料质量。【附图说明】图1为该菌株的菌落、分生孢子及分生孢子梗形态观察图，图中A为菌落形态图，B为分生孢子形态图，C为分生孢子梗形态图；图2为该菌株18S rDNA片段1%琼脂糖凝胶电泳结果，从图中可以看出，C2菌株18SrDNA片段长度约为600bp，符合常规的18S rDNA序列长度；图3为利用18S rDNA同源性序列和邻接法构建的该菌株的系统发育树，从图中可以看出C2菌株与青霉属的遗传进化距离最近；图4为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥温度的变化，从图中可以看出，实验组堆体第3天温度达到54°C进入高温期，最高温度达到65.5，°C高温期持续13d，在堆肥中试验组比对照组普遍高出5~9，°C说明接种分生孢子菌剂后，能够加速堆体升温，延长高温期。图5为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中的含水率变化，从图中可以看出，实验组含水率下降幅度较大，含水率降低了 23.56%，大于对照组的含水率降低量19.24% ；图6为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中总有机碳含量的变化，从图中可以看出，试验组总有机碳含量的下降幅度为13.03%，大于对照组下降的幅度10.53% ；图7为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中全氮含量的变化，从图中可以看出，在堆肥过程中试验组的含氮量始终高于对照组，这说明接种该菌剂对于堆肥保氮具有一定的作用；图8为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥中的C/N比的变化，从图中可以看出，试验组和对照组的碳氮比存在显著差异，这说明试验组加入C2菌剂能够加速堆肥腐熟进程；图9为分生孢子菌剂处理蚕沙堆肥对种子发芽指数的影响，从图中可以看出，在堆肥第17天，试验组的种子发芽指数达到53.14%，堆肥基本腐熟，而对照组则在堆肥第21天，种子发芽指数才达到51.05%,比试验组晚了 4d ;试验组在堆肥第29天，种子发芽指数达到81.24%，说明产品已经完全腐熟，而对照组比实验组晚了 12d才达到完全腐熟。【具体实施方式】本专利技术所涉及的培养基如下:1.富集培养基:蛋白胨 10.0g, CMC-Nal0.0g, K2HPO4L Og,Na2C035.0g, MgSO4.7Η200.lg, FeSO4.7Η200.015g, MnSO40.05g,酵母膏 IOg,蒸馏水 1000mL,pH 值 6.0 ;2.羧甲基纤维素培养基(CMC培养基):CMC-Nal5.0g, NH4NO3L 0g，酵母膏1.0g，MgSO4.7Η200.5g，KH2PO4L 0g，蒸馏水 lOOOmL，琼脂 15g ；3.纤维素刚果红培养基=K2HPO40.5g，微晶纤维素1.88g，MgSO40.25g，明胶2.0g,刚果红0.2g,琼脂14.0 g,蒸懼水1000mL,琼脂15g ；4.赫奇逊培养基:KH2PO41本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株保藏号为CGMCC?NO.8335的草酸青霉菌C2（Penicillium?oxalicum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其18S?rDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一株保藏号为CGMCC N0.8335的草酸青霉菌C2 (Penicillium oxalicum),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其18S rDNA序列如SEQ.1D.N0.1所示。2.利用如权利要求1所述的草酸青霉菌C2分生孢子菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)种子液的制备:用打孔器打取PDA平板培养的C2菌株圆形菌块2块，接种到50mL液体PDA培养基中，28~30、V 180~220r/min振荡培养18~20h...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘训理，刘鹏，姜红霞，周保强，鲍正宗，隋君康，赵旭，王晓辉，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：