快速检测恶喹酸的试纸条及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测恶喹酸的试纸条及其制备方法，该试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗恶喹酸多克隆抗体或单克隆抗体；在纤维素膜层上设有偶联恶喹酸的载体蛋白印制的检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹。本发明专利技术的试纸条结构简单，特异性强，灵敏度和准确度高，操作简便，适用范围广，价格低廉，易于推广应用，具有较好的社会和经济价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种快速检测恶喹酸的试纸条及其制备方法，该试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗恶喹酸多克隆抗体或单克隆抗体；在纤维素膜层上设有偶联恶喹酸的载体蛋白印制的检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹。本专利技术的试纸条结构简单，特异性强，灵敏度和准确度高，操作简便，适用范围广，价格低廉，易于推广应用，具有较好的社会和经济价值。【专利说明】
本专利技术属于兽药残留的免疫学检测领域，特别是涉及一种检测恶喹酸残留的免疫胶体金试纸条及制备方法。
技术介绍
恶喹酸(Oxolinic Acid，简称0A)，别名奥索利酸，分子式为C13H11NO5，分子量为261.23，属广谱类抗菌药物，特别是对革兰氏阴性菌有很强的抗菌活性，用量少，抗菌效果好，是治疗水生动物疾病的理想农药物之一。恶喹酸通常为白色或类白色的结晶性粉末，无臭无味，不溶于水和乙醇，能溶于甲酸和氢氧化钠溶液，不吸潮，对光、热稳定。但其对人体有一定毒副作用，常见的主要包括胃肠道反应、肝肾毒性以及肌肉骨骼副作用等，美国和日本禁用恶喹酸；欧盟和我国对其在牛、猪、鸡和鱼等肉类中的最高限量规定为50-300 μδ/kg。尽管我国兽药残留限量参照国际和发达国家标准制定，并且兽药使用都有休药期规定，但从根本上解决动物性食品兽药残留超标问题仍存在较大难度。因此急需研究建立快速、灵敏、有效的恶喹酸残留的检测方法。目前国内外检测恶喹酸残留的方法主要采用理化分析方法，包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)、气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)等，这些方法检测均存在一定缺陷:(I)待检测样品预处理过程复杂，繁琐费时；(2)需要昂贵的仪器设备，推广使用受到一定限制；(3)对专业人员的素质要求高，须有一定相关经验才能获得可靠结果；(4)仪器保养要求高，保养的好坏直接影响分析结果的准确性；(5)检测费用高；(6)无法进行现场检测和大规模批量检测，且时效性较差。免疫学检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度较高，精确性好，分析过程相对简单，用作恶喹酸的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术，急待研究解决。
技术实现思路
`本专利技术要解决的技术问题在于:克服现有技术存在的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便、精准快速的用于检测恶喹酸残留的试纸条及制备方法。本专利技术的技术方案: 一种快速检测恶喹酸的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗恶喹酸多克隆抗体或单克隆抗体；在纤维素膜层上设有偶联恶喹酸的载体蛋白印制的检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹。所述偶联恶喹酸的载体蛋白是通过以下方法得到的: 称取恶喹酸12mg溶入ImL N, N-二甲基甲酰胺溶液中，室温条件下加ΙΟμ?三丁胺混匀，再加IOPL氯甲酸异丁酯磁力搅拌反应3h，然后加入含20mg载体蛋白的PBS溶液，搅拌反应过夜；反应液用PBS透析3天,4000r/min离心5min,弃沉淀,得到恶喹酸的载体蛋白偶联物，分装并保存于-20°C，备用。所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。所述吸附纤维层用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附恶喹酸的金标抗体玻璃纤维棉制成。所述偶联恶喹酸的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“ I I ”直线式印迹、“十十”字型排列印迹、“丁丁”字型排列印迹、“丄丄”字型排列印迹、“ h卜，，字型排列印迹或“~1 H，，字型排列印迹。在所述吸附纤维层、金标抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3-0.6cm处印制有样品标记线。所述恶喹酸的试纸条的制备方法，包括以下步骤: (1)偶联恶喹酸载体蛋白的制备 将恶喹酸12mg溶入ImL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，室温条件下加ΙΟμ?三丁胺混匀，再加IOPL氯甲酸异丁酯磁力搅拌反应3h，然后加入含20mg载体蛋白的PBS溶液，搅拌反应过夜；用PBS透析3天，4000r/min离心5min,弃沉淀,得到恶喹酸的载体蛋白偶联物； (2)抗恶喹酸单克隆抗体或多克隆抗体的制备； (3)恶喹酸金标抗体的制备； (4)羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体的制备； 用所得的恶喹酸载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体在纤维素膜层上制备对照印迹；恶喹酸金标抗体用于制备金标抗体纤维层，然后依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。本专利技术的试纸条具有以下优点: ①特异性强，灵敏度高。本专利技术试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率，同时具有较强的特异性和较高的灵敏度，可检测到50 ng/g的微量恶喹酸。φ简便、快速。使用本专利技术试纸条，可现场操作。只需将试纸条插入被检样品中10~20秒钟，取出后5分钟内即可判定检测结果。(3)结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示棕红色“ I ”(或“十”、“ μ’、“.ι ”)印迹作为检测结果阳性和阴性标记，即在纤维素膜层上显示一条棕红色“ I ”印迹，表示被检样品中含有恶喹酸，显示两条棕红色“ I I ”印迹，表示被检样品中不含恶喹酸。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。φ节省费用。使用检测试纸条，无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备费用。(S)适用范围广，便于推广应用。操作简便，能满足不同层次人员的需要，该试纸条具有广阔的市场前景和明显的经济效益以及社会效益。⑥存储方便，保质期长。检测试纸条存储方便，且其对存储温度要求不高，在4-8°C下有效期可保持一年，室温下有效保质期可达到六个月。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术试纸条的俯视结构示意图。图2为图1试纸条的侧面结构示意图。图中，I为支撑层，2为吸附纤维层，3为金标抗体纤维层，4为纤维素膜层，5为吸水材料层，6为检测印迹，7为对照印迹，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。【具体实施方式】实施例一:快速检测微量恶喹酸的试纸条及制备方法，参见图1、图2。图中支撑层I用塑胶薄片条制成，吸附纤维层2用玻璃纤维棉制成，金标抗体纤维层3上吸附有抗恶喹酸的单克隆抗体，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜制成，吸水材料层5用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从右至左依次粘贴固定在支撑层I上，彼此交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测恶喹酸的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗恶喹酸多克隆抗体或单克隆抗体；在纤维素膜层上设有偶联恶喹酸的载体蛋白印制的检测印迹和用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，王栋，邢广旭，贾国超，王方雨，胡骁飞，杨继飞，
申请(专利权)人：河南百奥生物工程有限公司，河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：