IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术涉及工程改造的多价和多特异性结合蛋白，制备方法，和具体而言涉及其预防、诊断和/或治疗疾病中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途交叉引用相关申请本申请要求2010年12月21日申请的美国临时申请序列号61/425,671的优先权，其内容并入本文。专利
本专利技术涉及多价和多特异性结合蛋白，制备方法，且特别是其在急性和慢性炎性疾病、癌症和其他疾病的诊断、预防和/或治疗中的用途。专利技术背景工程改造的蛋白，诸如结合2种或更多种抗原的多特异性抗体是本领域已知的。此种多特异性结合蛋白可以使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术来产生。基于2种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，已使用四源杂交瘤(quadroma)技术(参见Milstein和Cuello(1983)Nature305(5934):537-40)产生了双特异性抗体，所述杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体(mAbs)。因为2种不同免疫球蛋白(Ig)重和轻链在所得到的杂合-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内随机配对，所以产生最高达10种不同Ig种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。错配对副产物的存在和显著减少的生产产量意味着需要复杂的纯化程序。双特异性抗体也可以通过2种不同mAbs的化学缀合来产生(参见Staerz等人(1985)Nature314(6012):628-31)。这种方法不产生均质制剂。其他方法已使用2种不同mAbs或较小抗体片段的化学缀合(参见Brennan等人(1985)Science229(4708):81-3)。用于产生双特异性抗体的另一种方法是用异双功能交联剂偶联2种亲本抗体，但所得到的双特异性抗体经受显著的分子异质性，因为交联剂与亲本抗体的反应不是定点的。为了获得更均质的双特异性抗体制剂，2种不同Fab片段已以定点方式在其铰链半胱氨酸残基上进行化学交联(参见Glennie等人(1987)J.Immunol.139(7):2367-75)。但这种方法产生Fab’2片段，而不是全IgG分子。已开发了广泛多样的其他重组双特异性抗体形式(参见Kriangkum等人(2001)Biomol.Eng.18(2):31-40)。在它们当中，串联单链Fv分子和双抗体(diabody)、及其各种衍生物是最广泛使用的。常规地，这些分子的构建从识别不同抗原的2个单链Fv(scFv)片段开始(参见Economides等人(2003)Nat.Med.9(1):47-52)。串联scFv分子(taFv)代表用另外的肽接头简单连接2个scFv分子的直接形式。这些串联scFv分子中存在的2个scFv片段形成分开的折叠实体。各种接头可以用于连接2个scFv片段且接头具有最多达63个残基的长度(参见Nakanishi等人(2001)Ann.Rev.Immunol.19:423-74)。尽管亲本scFv片段可以以可溶形式在细菌中正常表达，然而，常常观察到串联scFv分子在细菌中形成不溶性聚集体。因此，重折叠方案或哺乳动物表达系统的使用常规应用于产生可溶性串联scFv分子。在近期研究中，报道了通过转基因兔和牛体内表达针对CD28的串联scFv和黑素瘤相关蛋白聚糖(参见Gracie等人(1999)J.Clin.Invest.104(10):1393-401)。在这个构建体中，2个scFv分子通过CH1接头进行连接，且得到最高达100mg/L的双特异性抗体血清浓度。使用各种策略包括结构域顺序变化或使用具有不同长度或柔性的中间接头，以允许在细菌中可溶性表达。几项研究现在已报道了使用非常短的Ala3接头或长的富含甘氨酸/丝氨酸接头，在细菌中表达可溶性串联scFv分子(参见Leung等人(2000)J.Immunol.164(12):6495-502；Ito等人(2003)J.Immunol.170(9):4802-9；Karni等人(2002)J.Neuroimmunol.125(1-2):134-40)。在近期研究中，包含长度为3或6个残基的随机化中间接头的串联scFv所有组成成分(repertoire)的噬菌体展示，用于富集以可溶和活性形式在细菌中产生的那些分子。这种方法导致分离具有6个氨基酸残基接头的串联scFv分子(参见Arndt和Krauss(2003)MethodsMol.Biol.207:305-21)。这种接头序列是否代表串联scFv分子可溶性表达的一般解决方案仍不清楚。然而，这项研究证明串联scFv分子的噬菌体展示与定向诱变组合是富集这些分子的有力工具，所述分子可以以活性形式在细菌中表达。双特异性双抗体(Db)利用双抗体形式用于进行表达。通过使连接VH和VL结构域的接头长度减少至约5个残基，由scFv片段产生双抗体(参见Peipp和Valerius(2002)Biochem.Soc.Trans.30(4):507-11)。接头大小的这种减少通过使VH和VL结构域交叉配对促进2条多肽链的二聚化。双特异性双抗体通过在相同细胞内表达2条多肽链来产生，所述2条多肽链具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)、或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)。在过去已产生了品种繁多的不同双特异性双抗体，且它们中的大多数以可溶形式在细菌中表达。然而，近期的比较研究证明可变结构域的方向可以影响活性结合位点的表达和形成(参见Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(15):7021-5)。然而，在细菌中的可溶性表达代表超过串联scFv分子的重要优点。然而，因为2条不同多肽链在单一细胞内表达，所以可以产生无活性同源二聚体连同活性异源二聚体。这使另外纯化步骤的进行成为必需，以获得双特异性双抗体的均质制剂。促使双特异性双抗体产生的一种方法是把手进孔(knob-into-hole)双抗体的产生(参见Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(14):6444-8.18)。这对于针对HER2和CD3的双特异性双抗体进行了证明。通过用Phe交换Val37和用Trp交换Leu45将大把手引入VH结构域内，且在抗HER2或抗CD3可变结构域中，通过使Phe98突变为Met和使Tyr87突变为Ala在VL结构域中产生互补孔。通过使用这种方法，双特异性双抗体的产生可以从通过亲本双抗体的72％增至通过把手进孔双抗体的超过90％。重要的是，作为这些突变的结果的生产产量只有轻微减少。然而，对于几种构建体观察到抗原结合活性的减少。因此，这种相当精细的方法需要分析各种构建体，以鉴定产生具有不变结合活性的异源二聚分子的那些突变。此外，此种方法需要免疫球蛋白序列在恒定区的突变修饰，因此生成非天然和非自然形式的抗体序列，这可以导致免疫原性增加、体内稳定性差、以及不希望的药物代谢动力学。单链双抗体(scDb)代表改善双特异性双抗体样分子形成的可替代策略(参见Holliger和Winter(1997)CancerImmunol.Immunother.45(3-4):128-30；Wu等人(1996)Immunotechnology2(1):21-36)。双特异性单链双抗体通过用另外的中间接头连接2条双抗体形成多肽链来产生，所述另外的中间接头长度为约15个氨基酸残基。因本文档来自技高网...

【技术保护点】
结合蛋白，包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1?(X1)n?VD2?C?(X2)n，其中；VD1是第一个重链可变结构域；VD2是第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；X1是接头，条件是X1不是CH1；X2是Fc区；且n是0或1；其中所述结合蛋白能够结合抗原对，所述抗原对选自IL?1α和IL?1β。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.12.21 US 61/425,6711.结合蛋白，包含第一和第二多肽链，其中所述第一多肽链由第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中VD1是第一个重链可变结构域；VD2是第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；X1是接头，条件是X1不是CH1；X2是Fc区；n是0或1，且其中所述第二多肽链由第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中VD1是第一个轻链可变结构域；VD2是第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；X1是接头；X2不包含Fc区；n是0或1，且其中所述结合蛋白能够结合选自IL-1α和IL-1β的抗原对，其中所述VD1重和轻链可变结构域或VD2重和轻链可变结构域中的任一形成结合IL-1β抗原的抗原结合结构域，且由SEQIDNO:30和31或SEQIDNO:32和33的氨基酸序列组成，且其中所述VD1或VD2重和轻链可变结构域中的另一形成结合IL-1α抗原的抗原结合结构域。2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合IL-1α抗原的抗原结合结构域的重链可变结构域由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQIDNOs:40、42、44、和46，且其中所述结合IL-1α抗原的抗原结合结构域的轻链可变结构域由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQIDNOs:41、43、45、和47。3.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中X1由选自SEQIDNOs1-29的氨基酸序列组成。4.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两个第一多肽链和两个第二多肽链。5.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述Fc区是变体序列Fc区。6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述Fc区是具有L234A和L235A铰链区突变的变体IgG1Fc区。7.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链中的C-(X2)n由SEQIDNO:49的氨基酸序列组成；且所述第二多肽链中的C-(X2)n由SEQIDNO:50的氨基酸序列组成。8.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述VD1重和轻链可变结构域由SEQIDNOs:30和31的氨基酸序列组成。9.根据权利要求7所述的结合蛋白，其中所述VD1重和轻链可变结构域由SEQIDNOs:30和31的氨基酸序列组成。10.结合蛋白，能够结合两种抗原且包含四条多肽链，其中两条多肽链由VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中VD1是第一个重链可变结构域；VD2是第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；X1是接头；X2是Fc区；n是0或1，且其中另两条多肽链由VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中VD1是第一个轻链可变结构域；VD2是第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；X1是接头；X2不包含Fc区；n是0或1；且其中所述VD1重和轻链可变结构域形成结合IL-1β抗原的抗原结合结构域，且由SEQIDNOs:30和31或SEQIDNOs:32和33的氨基酸序列组成，且其中所述VD2重和轻链可变结构域形成结合IL-1α抗原的抗原结合结构域。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：C吴，
申请(专利权)人：ABBVIE公司，
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