本发明专利技术公开了一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用。是将甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，醛脱氢酶基因，丙酰辅酶A合成酶基因和聚羟基脂肪酸合成酶基因导入敲除了1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因的宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌。本发明专利技术降低了3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸的生产成本，实现了以同一菌体为宿主同时合成3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用。是将甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，醛脱氢酶基因，丙酰辅酶A合成酶基因和聚羟基脂肪酸合成酶基因导入敲除了1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因的宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌。本专利技术降低了3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸的生产成本，实现了以同一菌体为宿主同时合成3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。【专利说明】一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用。技术背景由于化石能源危机的日益严重以及利用化石能源带来的环境问题，制造生物燃料成为迫切问题。生物柴油是生物燃料的重要组成部分。随着生物柴油的大量生产，积累了大规模作为副产物的甘油。据估算,每生产10吨生物柴油大约生成I吨粗甘油。甘油的生产增长迅速，致使甘油价格一直较低，且还将会持续下降。充分利用甘油这种来源丰富、价格低廉的原料，可以带来巨大经济和环境效益。3-HP是一种重要的平台化合物。以3-HP为底物可以合成一系列具有较高商业价值的化学物质，如丙烯酸、1，3-丙二醇、丙烯酸甲酯、丙二酸、丙烯酰胺、羟基酰胺等。由3-HP还可以用于生产涂料、胶粘剂、抗冻剂、吸水树脂等高附加值产品。P3HP是一种非常有发展前景的生物降解性塑料，其生物材料性质和机械性能优良，如具有高机械强度和延展性、高断裂伸长量、生物兼容性、生物降解性、压电性、热塑性、不溶于水、无毒等。对比研究较多的生物降解性塑料聚乳酸(PLA)和聚3-羟基丁酸(PHB)，P3HP比PLA具有更好的稳定性而不易水解，因碳链骨架中不含甲基而比PHB更易被微生物降解。基于其优良性能，P3HP可以被用于地膜、矫形外科、个人卫生用品、药物控制、包装等领域。3-HP和P3HP均可以通过化学合成获得，但是化学合成途径具有原料受限、成本居高不下以及容易造成环境污染等问题；与化学法相比，生物合成操作简单、条件温和、绿色环保。越来越多的科研工作者将研究重点放在了生物合成途径上。已知的由甘油制备3-HP的微生物包括脱硫弧菌属的Desulfovibriocarbinolicus 和 Desulfovibrio fructosovorans、威尼斯暗杆菌(Pelobactervenetianus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和多营养泥杆菌(Ilyobacterpolytropus)，但是，以上微生物合成3-HP的产量很低，代谢途径不清。可以直接合成P3HP的微生物尚未发现。研究人员把研究重点放在了构建基因工程菌合成3-HP或P3HP上。已报道的3-HP或P3HP的合成只针对二者中某一种的合成，尚未发现以同一菌体为宿主实现3-HP和P3HP同时合成的报道。`
技术实现思路
本专利技术提供了一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，是将甘油脱水酶基因(dhaB123)和甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)，醛脱氢酶基因(aldH)，丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)以及聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)导入宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌；所述重组肺炎克雷伯氏菌是敲除了 1，3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到的。本专利技术不仅克隆了 E.coli醒脱氢酶基因aldH,同时克隆了 K.penumoniae的甘油脱水酶基因dhaB123及甘油脱水酶激活再基因gdrAB，构建重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB,以甘油为底物达到合成3-HP的目的。本专利技术克隆了丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)，构建了重组质粒pBAD 18-phaC-prpE。本专利技术所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，是敲除了与副产物1，3-丙二醇合成相关的基因1，3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT和醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD，达到减少副产物1，3-丙二醇的合成并提高目的产物3-羟基丙酸产量的目的。本专利技术通过将重组质粒pBAD33_aldH-dhaB123-gdrAB 和 pBAD18_phaC_prpE 导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌实现3-HP和P3HP的联产。所述甘油脱水酶基因来自肺炎克雷伯氏菌。所述甘油脱水酶再激活酶基因来自肺炎克雷伯氏菌。所述醛脱氢酶基因来自大肠埃希氏杆菌。所述丙酰辅酶A合成酶基因来自大肠埃希氏杆菌。所述聚羟基脂肪酸合成酶基因来自产碱杆菌属真氧产碱杆菌。所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，为缺失了 1，3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)和醛还原酶/醇脱氢酶基因(yqhD)的菌株。所述醛脱氢酶基因(aldH)、甘油脱水酶基因(dhaB123)和甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)通过重组载体pBAD33-al dH-dhaB 123-gdr AB (pEdg)导入所述宿主菌中。`所述聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)以及丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)通过重组载体pBAD18_phaC_prpE (pBAD18-pp)导入所述宿主菌中。本专利技术还提供了一种制备联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌的方法，技术方案如下:I)克隆醛脱氢酶基因，同时克隆甘油脱水酶基因及甘油脱水酶再激活基因，构建重组质粒 pBAD33-al dH-dhaB 123-gdr AB ；2)克隆聚羟基脂肪酸合成酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因，构建重组质粒PBAD18-phaC-prpE ；3)敲除肺炎克雷伯氏菌的1，3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到宿主重组肺炎克雷伯氏菌；4)将重组质粒 pBAD33_al dH-dhaB 123-gdr AB 和 pBAD18_phaC_prpE 导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌得到联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌。所述缺失基因的方法采用同源重组法，在本领域技术人员的能力范围之内。所述重组载体导入宿主菌的方法采用电击转化法。本专利技术还提供了一种联产3-HP和P3HP的方法，是以联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌发酵生产3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。所述方法在以甘油为碳底物的培养集中培养，添加适当的表达诱导剂后可以同时合成3-HP和P3HP。本专利技术以K.penumoniae宿主菌,在合成产物时不需要加入维生素B12,可以降低生产成本；敲除了宿主菌合成副产物1，3-丙二醇的相关基因，减少了副产物1，3-丙二醇的合成，提高了目的产物3-HP的产量；实现了在同一菌体内同时合成3-HP和P3HP。定义和缩写在本文中使用下列的缩写或简称:3-羟基丙酸:3-HP聚3-羟基丙酸:P3HP甘油脱水酶基因:dhaB123甘油脱水酶再激活酶基因:gdrAB大肠杆菌醛脱氢酶基因:aldH聚羟基脂肪酸合成酶基因:phaC丙酰辅酶A合成酶基因:prpEI, 3-丙二醇脱氢酶基因:dhaT醛还原酶/醇脱氢酶基因:yqhD大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli):E.coli肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae):K.penumoniae`PBAD33-EaldH-dhaB123_gdrAB 载体:pEdg 质粒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种联产3?HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，包含：将甘油氧化为3?羟基丙醛的酶，将3?羟基丙醛氧化为3?HP的酶，将3?羟基丙酸转化为3?羟基丙酰辅酶A的酶，将3?羟基丙酰辅酶A聚合为聚3?羟基丙酸的酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，冯新军，赵广，张汝兵，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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