一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法技术

一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，属于纳米生物技术领域。本发明专利技术包括：金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立。本发明专利技术提供了一种新型的手性材料的制备方法，该方法是在原非手性组装材料的基础上，通过外加DNA的引入对其几何构象进行重构，从而将非手性纳米材料转变为手性纳米材料；利用圆二色谱可见光区（520nm）的信号变化，实现在阿摩尔（10-18）水平对目标DNA进行快速、高效、超灵敏地检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，属于纳米生物
。本专利技术包括：金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立。本专利技术提供了一种新型的手性材料的制备方法，该方法是在原非手性组装材料的基础上，通过外加DNA的引入对其几何构象进行重构，从而将非手性纳米材料转变为手性纳米材料；利用圆二色谱可见光区（520nm）的信号变化，实现在阿摩尔（10-18）水平对目标DNA进行快速、高效、超灵敏地检测。【专利说明】一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法
一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，具体涉及一种用于DNA超灵敏检测的手性纳米材料的制备及DNA的检测方法，属于纳米生物
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技术介绍
脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的承担者，可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。由于DNA分子中碱基序列的变异与人类许多遗传疾病有关，因此，对特定序列的DNA的分析以及对DNA链中碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗方面具有十分深远的意义。传统DNA的检测方法主要是基于聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)。PCR是一种在体外扩增DNA片段的重要技术。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，痕量模板DNA可扩增至几百万倍。PCR技术可以将部分DNA序列进行复制，信号放大，在灵敏度方面代表了检测的极限。尽管如此，PCR技术仍然存在一些固有的缺点，如成本高、需要专业技能和设备以及依赖聚合酶的操作、容易出现假阳性等，这些特点都严重阻碍了 PCR的广泛应用。随着纳米科学技术的兴起，纳米材料由于其独特的物理和化学属性已成为制备生物传感器的中流砥柱。纳米材料是一类结构单元的尺寸介于1-1OOnm范围之间的材料，由于它的尺寸已经接近电子的相干长度，它的性质因为强相干所带来的自组装超结构的性质发生很大变化。并且，其尺度已接近光的波长，加上其具有大表面的特殊效应，因此其所表现的特性，例如熔点、磁性、光学、导热、导电特性等等，往往不同于该物质在整体状态时所表现的性质。纳米传感器因仪器简单、价格低廉、测定快速准确和方法灵敏度高等特点已经广泛应用于环境、医药、食品等的检测中。手性纳米材料结合了纳米材料特殊的物理性质和手性分子化学结构上镜像对称性，这种新型复合材料可以将手性信号从紫外光区转移到可见光区，从而大大拓展了其应用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于DNA超灵敏检测的手性纳米材料的制备及DNA的检测方法。本专利技术的技术方案:一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立。工艺步骤为: (1)金纳米粒子的合成 柠檬酸和单宁酸两步法合成IOnm金纳米粒子； (2)金纳米粒子的表面修饰 步骤(I)合成的金纳米粒子用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹，使得纳米粒子表面负电荷更多，以提高胶体金在高盐溶液中的稳定性； (3)DNA-金纳米粒子复合物的合成步骤(2)修饰的金纳米粒子与末端带巯基的DNA按照一定比例混合反应；所用的DNA 共有四种(Yl，Y2, Y3, Y4，)，形成四种不同的 Au-DNA 复合物(Au_Yl，Au_Y2，Au_Y3，Au-Y4)；【权利要求】1.一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，其特征在于包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立；工艺步骤为: (1)金纳米粒子的合成 柠檬酸和单宁酸两步法合成IOnm金纳米粒子； (2)金纳米粒子的表面修饰 步骤(I)合成的金纳米粒子用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹，使得纳米粒子表面负电荷更多，以提高胶体金在高盐溶液中的稳定性； (3)DNA-金纳米粒子复合物的合成 步骤(2)修饰的金纳米粒子与末端带巯基的DNA按照一定比例混合反应；所用的DNA共有四种:Υ1, Υ2，Υ3, Υ4，形成四种不同的 Au-DNA 复合物:Au-Yl, Au_Y2，Au_Y3，Au_Y4 ； 2.根据权利要求1所述的基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，其特征在于: (I)金纳米粒子的合成 柠檬酸和单宁酸两步法合成IOnm金纳米粒子的方法为:分别取两个洁净的三角瓶，A瓶中加入158mL超纯水和2mL质量浓度1%氯金酸；B瓶中加入8mL质量浓度1%柠檬酸三钠，0.2mL质量浓度1%单宁酸，0.2mL 25mM碳酸钾，31.6mL超纯水；A、B液均加热到60°C，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60°C下继续搅拌40分钟到形成深红色溶液；最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10±2nm ；(2)金纳米粒子的表面修饰 步骤(I)合成的10nm柠檬酸根修饰的金纳米粒子取100mL于离心管中，13000r/min浓缩10倍至终浓度为50nM，加入IOyL 20mg/mL 二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10小时；用13000r/min，离心10分钟后去除上清液，加水恢复到原体积； (3)DNA-金纳米粒子复合物的合成 步骤(2)修饰好的金纳米粒子各取50 μ L于四个PCR管中，向四个PCR管中依序各自加入IyL ΙΟμΜ的Υ1，Υ2，Υ3及Υ4混匀后，向各体系中加入5yL 5Xtris-硼酸缓冲液和1.25 μ L IM NaCl溶液，室温振摇反应2小时；合成好的Au-DNA复合物用13000r/min离心10分钟，去除上清液，沉淀加I Xtris-硼酸缓冲液至原体积； 合成好的四种 Au-DNA 复合物为:Au-Yl，Au_Y2，Au_Y3，Au_Y4 ； 【文档编号】C12Q1/68GK103468810SQ201310422737【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日【专利技术者】徐丽广, 严文静, 胥传来, 匡华, 马伟, 刘丽强, 王利兵 申请人:江南大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，其特征在于包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA?金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立；工艺步骤为：（1）金纳米粒子的合成柠檬酸和单宁酸两步法合成10nm金纳米粒子；（2）金纳米粒子的表面修饰步骤（1）合成的金纳米粒子用二水合双(对?磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹，使得纳米粒子表面负电荷更多，以提高胶体金在高盐溶液中的稳定性；（3）DNA?金纳米粒子复合物的合成步骤（2）修饰的金纳米粒子与末端带巯基的DNA按照一定比例混合反应；所用的DNA共有四种：Y1,?Y2，Y3,?Y4，形成四种不同的Au?DNA复合物：Au?Y1，Au?Y2，Au?Y3，Au?Y4；Y1：5’?SH?TTT?GCC?TGG?AGA?TAC?ATG?CAC?ATT?ACG?GCT?TTC?CCT?ATT?AGA?AGG?TCT?CAG?GTG?CGC?GTT?TCG?GTA?AGT?AGA?CG?3’；Y2：5’??SH?TTT?CGC?GCA?CCT?GAG?ACC?TTC?TAA?TAG?GGT?TTG?CGA?CAG?TCG?TTC?AAC?TAG?AAT?GCC?CTT?TGG?GCT?GTT?CCG?GGT?GTG?GCT?CGT?CGG?3’；Y3：5’??SH?TTT?GGC?CGA?GGA?CTC?CTG?CTC?CGC?TGC?GGT?TTG?GCG?AAC?TGG?TCC?TC?ATG?TCT?CAT?CT?CGT?CTA?CTT?ACC?GTT?TCC?GAC?GAG?CCA?CAC?CCG?GAA?CAG?CCC?3’；Y4：5’??SH?TTT?GCC?GTA?ATG?TGC?ATG?TAT?CTC?CAG?GCT?TTC?CGC?AGC?GGA?GCA?GGA?GTC?CTC?GGC?CTT?TGG?GCA?TTC?TAG?TTG?AAC?GAC?TGT?CGC?3’；（4）金纳米粒子四面体的组装将步骤（3）合成的四种Au?DNA复合物，等比例混合组装形成金纳米粒子四面体；（5）手性四面体的构建步骤（3）所用的四种DNA中，其中Y3中间嵌入了一段含13个碱基的DNA环；在步骤（4）组装的过程中加入与Y3内嵌的DNA环完全互补的序列Y5，此时Y5会与?Au?Y3中的DNA环互补杂交，使DNA环被完全打开，四面体中两个纳米粒子之间的距离拉大，原本对称的金纳米粒子四面体的构象被改变，变成不对称的空间四面体结构，从而使得原本没有手性信号的结构出现手性信号；（6）目标DNA手性传感器的建立根据步骤（5）的方法构建基于手性检测的DNA传感器：在步骤（4）的制备过程中加入不同浓度的目标DNA：Y5，根据520nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线；本专利技术中，DNA的检测限为43aM，线性范围在0.05fM?50fM；Y5：5’?AG?ATG?AGA?CAT?GA?GGA?CCA?GTT?CGC?C?3’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽广，严文静，胥传来，匡华，马伟，刘丽强，王利兵，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：