以整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并将此酶用于生产海藻糖的方法。具体是将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产海藻糖合成酶。经过简单分离，发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造。本发明专利技术的优点是：本发明专利技术利用食品安全的表达系统生产海藻糖合成酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，表达的海藻糖合成酶分泌到胞外，无抗菌活性，达到食品应用酶制剂要求，有利于下一步海藻糖的制造。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体是，并将生产得到的海藻糖合成酶用于制造海藻糖的方法。
技术介绍
海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷键相连而成，在自然界中广泛存在的天然性二糖。它自身性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有保护作用。近年来，研究发现海藻糖能广泛应用于各类食品的鲜味保持及质地改善。随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们对食品的质量和口感日趋重视，这加大了人们对海藻糖的需求。因此，大规模的廉价高效生产海藻糖具有极大的经济价值，同时也将更能推广和普及海藻糖在食品领域的使用。研究已发现自然界中有多种酶系能够合成海藻糖。其中一种是在许多微生物中都能发现的海藻糖合成酶(Trehalose Synthase)。此酶能够将麦芽糖直接转化成为海藻糖，比较适宜应用于工业化生产海藻糖。研究已发现来源于脂肪杆菌(Pimelobacter species) ,弯曲高温单抱菌(Thermomonospora curvata),谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),耐放射性异常球菌(Deinococcus radiodurans)以及水栖嗜热菌(Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶能够高效的将麦芽糖转化成为海藻糖。目前，已有的成功报道都是直接从原始菌株中培养分离，或者利用重组质粒在大肠杆菌中表达。从原始菌株中培养分离往往因为原始菌株表达的酶活不高而影响大规模生产，而大肠杆菌表达系统也存在一些缺陷，如含有内毒素、肠毒素、难以分泌表达，产物需要破胞提取等，而且为了保持质粒的稳定性，在生产过程中一般需要使用抗生素。为了避免重组微生物发酵过程中残留的抗生素类物质对于食品安全的影响，国际上对微生物来源的酶制剂的抗菌活性有严格限制，中国在食品工业用酶制剂的食品安全国家标准(GB 25594— 2010)中也明确规定微生物来源的酶制剂不得检出抗菌活性，这对食品用酶制剂提出了更高的要求。枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，不产内毒素和致热致敏蛋白质，是一种食品安全的菌种。另外，枯草芽孢杆菌表达系统还具有以下优点:1、具有很强的蛋白质分泌功能，不需要破碎细胞来提取蛋白质，只需要较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质。2、没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包函体。3、发酵条件简单。因此，开发利用枯草芽孢杆菌表达系统生产食品添加剂具有深远的意义和广阔的市场前景。根据所采用载体类型不同，枯草芽孢杆菌表达模式可分为可复制质粒表达和染色体整合表达。复制质粒通常在枯草芽孢杆菌中不很稳定，这限制了外源基因的高效表达。同时也存在着在生产过程中需要使用抗生素的问题。目前还没有发现利用整合型枯草芽孢杆菌表达系统表达生产海藻糖合成酶，进而利用获得的海藻糖合成酶制造海藻糖的研究报告。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并利用获得的海藻糖合成酶制造海藻糖的方法。利用整合质粒将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到海藻糖合成酶。经过简单分离，发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造.本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下:1.一种能够以整合型的方式表达海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为:将海藻糖合成酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；所述的海藻糖合成酶表达元件包含如下组分:能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和海藻糖合成酶基因；所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43,或来源于地衣芽孢杆菌(BaclicusIincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；所述的海藻糖合成酶基因为来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的海藻糖合成酶基因，来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶基因，或来源于水栖嗜热菌(Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶基因。所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒；所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751，WB600,和WB800。2.一种利用以整合型的方式表达海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌菌株来生产海藻糖合成酶及制备海藻糖的方法，其特征在于，工艺步骤如下:I) 一级种的制备:从含新霉素20ug/ml的LB平板上接上述枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在4ml LB 液体培养基37°C、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；2) 二级种的制备:一级种接种于800ml LB液体培养基，于37°C，220rpm培养至0D600为0.6左右(约4 5小时)；3)三级种的制备:将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37°C，以柠檬酸、NaOH控pH 7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20 30%，培养至0D600为0.6左右(约5 6小时)；4)生产罐发酵:将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36 38°C，通风搅拌，溶氧控制在20 30%，以柠檬酸、NaOH控pH 6 8，培养约26小时，IOOOOg离心力离心除菌，用截留分子量5000 10000超滤膜浓缩上清液后，即得海藻糖合成酶浓缩原液；5)以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，通过常规酶法转化生产海藻糖的方法利用上述重组海藻糖合成酶溶液制造海藻糖。本专利技术首次将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌种，常规的生产工艺，发酵生产海藻糖合成酶。生产的海藻糖合成酶经过简单分离纯化可直接用于制造海藻糖。本专利技术的优点是:本专利技术利用食品安全的表达系统生产海藻糖合成酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，表达的海藻糖合成酶分泌到胞外，无抗菌活性，达到食品应用酶制剂要求，有利于下一步海藻糖的制造。具体实施例方式避免表达系统中质粒不稳定的最有效途径是使用枯草芽孢杆菌整合质粒，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中，外源基因随染色体的复制而复制和表达，这样外源基因在宿主中可保持较好的稳定性。本专利技术用到的整合质粒PMLK83购自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC, http://www.bgsc.0rg),该质粒有两段与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在这两段同源臂中有新霉素抗性基因；另外该质粒有大肠杆菌复制子而无枯草芽孢杆菌复制子，因此能在大肠杆菌中复制而不能在枯草芽孢杆菌中复制。质粒转化到枯草芽孢杆菌时，通过新霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够以整合型的方式表达海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：将海藻糖合成酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；所述的海藻糖合成酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和海藻糖合成酶基因；所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌（Baclicus?lincheniformis）麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium?thermosulfurogenes)的β?淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌（Bacillus?brevis）的ɑ?乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；所述的海藻糖合成酶基因为来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium?glutamicum)的海藻糖合成酶基因，来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora?curvata)的海藻糖合成酶基因,或来源于水栖嗜热菌（Thermus?aquaticus)的海藻糖合成酶基因，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒；所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751, WB600,和WB800。...

【技术特征摘要】
1.一种能够以整合型的方式表达海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为: 将海藻糖合成酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌； 所述的海藻糖合成酶表达元件包含如下组分:能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和海藻糖合成酶基因； 所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43,或来源于地衣芽孢杆菌(BaclicusIincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子； 所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断； 所述的海藻糖合成酶基因为来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的海藻糖合成酶基因，来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶基因，或来源于水栖嗜热 菌(Thermus a...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄日波，李晓明，罗兆飞，韦航，韦宇拓，蒙健宗，廖东庆，韦玉琴，李丛，卢运琨，
申请(专利权)人：南宁中诺生物工程有限责任公司，
类型：发明
国别省市：