本文中描述了可用于测定并定量AAD-1(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)酶的存在的单克隆抗体和方法。令人惊讶地，这些单克隆抗体完全适合于检测多种植物和植物组织中的AAD-1转基因事件基因产物。本发明专利技术进一步提供了使用本发明专利技术的免疫球蛋白的定量和定性免疫测定法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,4-二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体和检测方法, 4- 二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体和检测方法对相关申请的交叉引用本申请要求2010年9月15日提交的美国临时申请流水号61/383，015的权益，其公开内容在此通过提述完整(包括所有图、表和氨基酸或核酸序列)并入。
技术介绍
2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)属于苯氧酸类的除草剂，并且已经在许多单子叶植物作物诸如玉米、小麦、和稻中用于选择性控制阔叶杂草，而对期望的作物植物没有严重损害。2，4-D是一种合成生长素衍生物，其作用为使正常的细胞-激素体内稳态脱调节并阻碍平衡的、受控的生长；然而，尽管田间应用超过60年，这类除草剂的确切作用模式仍未得到完全了解。定草酯(t riclopyr)和氟草烟(fluroxypyr)是卩比唳基氧乙酸除草剂,它们也充当合成生长素。这些除草剂对某些植物具有不同的选择性水平(例如双子叶植物比单子叶植物更敏感)。不同植物的差异代谢是对选择性水平变化的一种解释。一般地，植物缓慢代谢2，4-D，因此对2，4-D的植物响应变化可能更有可能通过靶位置处的不同活性解释(WSSA, 2002;Herbicide Handbook 第 8 版；Weed Science Society ofAmerica;Lawrence, KS第492页)。2，4-D的植物代谢通常经由两阶段机制(通常是轻基化，接着是与氨基酸或葡萄糖缀合)发生(WSSA，2002)。随着时间推移，用2，4-D攻击的某些微生物群已经形成一种用于降解此异生素的替代途径，这导致2，4-D的完全矿化。除草剂的连续应用选择出能利用该除草剂作为碳源和能源进行生长的微生物，给予它们在土壤中的竞争优势。出于此原因，目前配制的2，4-D具有相对较短的土壤半衰期，并且对后续的作物没有显著的遗留影响。—种已经对其降解2，4-D的能力进行过广泛研究的生物体是真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha) (Streber 等；1987;Analysis, cloning, and high-levelexpression of2, 4-dichlorophenixyacetic monooxygenase gene tfdA of Alcaligeneseutrophus JMP134.J.Bacteriol.169:2950-2955)。编码矿化途径起始步骤中的酶的基因是tfdA。参见美国专利N0.6，153，401和GENBANK登录号M16730。TfdA基因产物经由α -酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2，4-D到二氯苯酚(DCP)的转化(Smejkal等；2001.Substrate specificity of chlorophenoxyalkanoic acid-degrading bacteriais not dependent upon phylogeneticalIy related tfdA gene types.Biol.Fertil.Sols33:507-513)。DCP相比于2，4-D具有很少的除草剂活性。已经在转基因植物中使用TfdA来在对2，4-D天然敏感的双子叶植物诸如棉和烟草中赋予2，4-D抗性(Streber等；1989.Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme areresistant to2, 4-D.Bio/Technology7:811-816 和美国专利 N0.5, 608, 147)。已经从土壤细菌中分离出编码能够降解2，4-D的酶的大量tfdA型基因，并且将其序列存储于Genbank数据库中。许多tfdA同源物(大于85%氨基酸同一'丨生)与tfdA具有类似的酶特性。然而，存在许多如下的同源物，其与tfdA具有显著较低的同一性(25-50%)，但具有与α-酮戊二酸双加氧酶Fe+2双加氧酶有关的特征性残基。因此，在其它生物化学特征外，这些趋异的双加氧酶的底物特异性是什么并不明显。一个与tfdA具有低同源性(28%氨基酸同一1丨生)的独特例子是来自Sphingobiumherbicidovorans 的 rdpA(Kohler, H.P.E.1999;Sphingobium herbicidovorans MH: aversatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrader.J.1nd Microbiol andBiotech.23:336-340.Westendorf A.,D.Benndorf,R.MulIer，ff.Babel.2002.The twoenantiospecific dichlorprop/a-ketoglutarate-dioxygenases from Delftiaacidovorans MCl-protein and sequence data of RdpA and SdpA., Microbiol.Res.157:317-22.)。已经显示了此酶催化(R)-滴丙酸(dichlorprop)(和其它(R)-苯氧丙酸)以及2，4_D(—种苯氧乙酸)矿化中的第一步(ffestendorf, A., R.H.Muller, andff.Babel.2003.Purification and characterization of the enantiospecificdioxygenases from Delftia acidovorans MCI initiating the degradation ofphenoxypropionates and phenoxyacetate herbicides.Acta Biotechnol.23:3-17)。虽然以前有时描述降解苯氧基丙酸的生物体，但是在表征此途径上很少做出进展(Horvath, M., G.Ditzelmuller,M.Lodl 和 F.Streichsbierl990).Isolation andcharacterization of a2-(2, 4-dichlorophenoxy)propionic acid-degradingsoil bacterium.Appl.Microbiol.Biotechnol.33:213-216.) 牵涉滴丙酸的摄取(Kohler, 1999)和初始氧化(Westendorf等，2003)两者的立体专一性(R对S)使滴丙酸降解更为复杂化。至今尚未报告rdpA在其它微生物中的异源表达，或此基因对植物的转化。文献主要聚焦于紧密的tfdA同源物，其主要降解非手性苯氧基乙酸(例如，2，4-D)。经植物密码子优化的芳氧基链烷酸酯双加氧酶基因AAD-1 (其编码最初从食酸代尔夫特菌分离的酶)在W02005/107437 (其通过提述并入本文)中在作为除草剂抗性性状使用方面第一次描述。该性状赋予对2，4-D及对吡啶基氧乙酸除草剂的耐受性。携带AAD-1基因的经转化玉米第一次报告于美国临时专利申请号61/235248，其通过提述并入本文。为种植种子产品开发并销售重组DNA性状的公本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：SK恩布里，林高峰，单国民，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：
国别省市：
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