本发明专利技术提供一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法，该试剂盒包括：电化学传感阵列、酶结合物工作液、酶底物、阴性对照品、阳性对照品、样本稀释液和洗涤液，电化学传感阵列包括印刷碳电极以及表面共组装的血吸虫抗原层和吸附的封闭剂层，血吸虫抗原为SjE16和SEA的混合物，酶结合物工作液为含有辣根过氧化酶标记的二抗的BSA溶液，酶底物为四甲基联苯胺与双氧水的混合物，阴性对照品为正常血清，阳性对照品为血吸虫感染血清，样本稀释液和洗涤液均为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。本发明专利技术的试剂盒制备简单、成本低廉、可进行多样本分析，且检测灵敏度、特异性及重现性好，有望用于疫区血吸虫病患者筛查及监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及。
技术介绍
血吸虫病是世界上分布最广泛的人畜共患寄生虫病之一，其严重危害着人类健康并直接影响着全球经济发展。在我国，血吸虫病虽然得到了一定的控制，但其仍然是一个重要的公共卫生问题。目前，血吸虫病的诊断仍然是血吸虫病防治工作的关键，它是寻找并确定指示血吸虫在机体存在的直接或间接证据，为血吸虫感染的临床诊断提供依据。血吸虫病传统的检测方法为粪检等病原学检测，但该方法在中度或低度血吸虫病流行区域的敏感性并不令人满意，且费时、费力、漏检率较高，而且不能对该病进行早期诊断。为了解决这一问题，至今逾半个世纪研究者们一直致力于免疫学诊断方法的研制，目前免疫学诊断已被广泛用于血吸虫病的筛查及监测，并成为血防工作的主要手段，常用的方法主要包括换卵沉淀实验(C0PT)，酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接血凝实验(IHA)等，但由于这些方法均有一定的缺陷，灵敏度仍不够高，操作复杂费时，且需要昂贵的仪器及技术熟练的分析人员，严重阻碍了其在现场大规模筛查中的应用，不能完全适应目前血吸虫病防治工作的需要。目前，比较常用的商业化日本血吸虫抗体检测试剂盒大多是采用粗制的虫卵抗原，虽然其诊断灵敏度高，但由于其常常含有宿主抗原或其他寄生虫抗原的共有成分，易产生交叉反应，特异性较低。此外由于天然抗原的来源有限，且虫卵抗原的提取及纯化过程比较复杂，难以控制且耗资大，大大限制了其在大规模筛查中的应用。为了实现对血吸虫病的有效控制，我们迫切需要开发新型快速诊断方法及试剂，实现血吸虫的快速、灵敏、便携检测，为血吸虫病的现场筛查及监测提供技术支撑。电化学免疫传感器是将免疫测定技术与电化学传感技术相结合的一类新型生物传感器。其工作原理类似于传统的免疫分析技术，即把抗原或抗体固定在固相载体表面(即电极上)，通过抗原抗体特异性结合来检测样品中的抗体或抗原。目前，其已发展成为一种分析浓度范围宽，适用于多种生物基质的有力分析工具。通过特定的标记物进行标记，该方法还能实现信号的放大，因此，具有较高的灵敏性。对于混合样品中微量的待测物，不论从灵敏度、特异性，还是分析时间和可操作性方面考虑，电化学免疫传感器都将成为首选的检测方法且有着巨大的应用前景。前期已有研究报道将电化学免疫传感技术用于血吸虫抗体的检测，例如俞汝勤课题组通过在玻碳电极上修饰Nafion来固定血吸虫抗原，用免疫竞争的方法进行血吸虫抗体的检测，其主要采用重组血吸虫抗原作为诊断抗原，灵敏度并不够高，且其所用的电极多为单一圆盘电极，前处理及抗原固定方法比较复杂，且需配合其他辅助电极进行检测，不太适合多样本分析。近年来，随着丝网印刷技术的发展，批量制备成本低廉、重现性好的丝网印刷电极已成为可能并广泛应用于生物检测。印刷电极芯片的发展为开发适用于实际检测的便携式、可弃型电化学免疫传感器提供了便利。迄今为止，仍没有基于电化学传感阵列技术的血吸虫快速测定方法及试剂被研制出来。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中血吸虫病检测方法敏感性不高，费时、费力、漏检率较高，而且不能对该病进行早期诊断的缺陷，提供一种具有高敏感性及特异性的血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒及其检测方法和制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案:提供一种血吸虫病电化学传感快速测定(ECISA)试剂盒，所述试剂盒包括:电化学传感阵列、酶结合物工作液、酶底物、阴性对照品、阳性对照品、样本稀释液和洗涤液，所述电化学传感阵列包括印刷碳电极、共组装在所述印刷碳电极表面的血吸虫抗原层和吸附的封闭剂层，所述血吸虫抗原为日本血吸虫重组抗原SjE16和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA的混合物，所述酶结合物工作液为含有辣根过氧化酶标记的二抗的BSA溶液，所述酶底物为四甲基联苯胺与双氧水的混合物，所述阴性对照品为正常血清，所述阳性对照品为血吸虫感染血清，所述样本稀释液和洗涤液均为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。所述日本血吸虫重组抗原SjE16具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以4:1 64:1质量比混合。所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以8:1质量比混合。采用该质量比时灵敏度最高。所述印刷碳电极由碳糊工作电极，碳糊对电极以及银/氯化银参比电极组成。所述封闭剂是牛血清白蛋白或酪蛋白。还提供一种血吸虫抗体的检测方法，所述检测方法包括:1)样本稀释:用样本稀释液将待检血清按1:100稀释；2)加样反应:向每个工作电极上分别滴加已稀释的样本血清，每个样本平行检测2孔，同时设阴性、阳性及空白对照各2孔，取阴性、阳性对照品分别滴加于工作电极表面，空白对照孔仅加入样本稀释液，将电极阵列于湿盒内室温反应20-40分钟后，甩去电极表面液体，并用洗涤液冲洗，吹干电极表面；3)加酶反应:每个工作电极表面滴加酶结合物工作液，于湿盒内室温反应20-40分钟，甩去电极表面液体，并用洗涤液冲洗；4)电化学检测:每个通道滴加酶底物，覆盖三电极区域，于多通道电化学分析仪上进行时间电流曲线扫描，扫描电压为-lOOmv，扫描时间是50s。50s时的稳态电流值作为检测信号；5)数据分析与结果判断:定性检测:所有电流值都扣除空白对照的电流值，以阴性对照品的平均电流值的2.1倍作为阈值，待检样本电流值大于或等于阈值的样本判定为阳性样本，电流值小于阈值的样本判定为阴性样本；半定量检测:待检样品所含的血吸虫抗体的效价为样品连续稀释电极中判定为阳性电极的最高稀释倍数的倒数，该阳性电极结果判定方法与定性检测相同。还提供一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒的制备方法，所述制备方法包括:电化学传感阵列的制备:滴加磷酸缓冲液覆盖三电极，于多通道电化学检测仪上进行循环伏安法扫描，冲洗电极，再在工作电极表面滴加碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的羧基活化溶液，室温反应后用超纯水冲洗，再在所述工作电极表面滴加含有日本血吸虫重组抗原SJE16和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA的PBS溶液，室温反应I 3h后冲洗电极，滴加封闭剂覆盖三电极，室温孵育后冲洗电极，吹干表面，备用。所述制备方法还包括:酶结合物工作液的配置:将辣根过氧化物酶标记的二抗用1%BSA溶液稀释1000倍；酶底物工作液的配置:将四甲基联苯胺与双氧水配置为混合溶液，棕色试剂瓶避光保存；样本稀释液或洗涤液的配置:将TWeen20加入磷酸盐缓冲液中混匀；阴性对照品的制备:将10份正常人标准血清混合并用稀释液稀释100倍；阳性对照品的制备:将10份血吸虫感染人标准血清混合并用稀释液稀释100倍。所述日本血吸虫重组抗原SjE16具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:MSDENRffIAV FNSLDKDGNK LLTRDEIEQC LKSLGVSESF AEKIIKETDL NKDGKISLDE YLKALPKIPPRDKCSSVERff KEVFQSIDKD NSGKVSAKEL DEFLKSTGND INKSCLENWM ATNDKNKDGE LDYAEFLAYVRQTYE。所述日本血吸虫重组抗原SjE16和所述日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA两者以4:1 64:1质量比混合。所述日本血吸虫重组抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种血吸虫病电化学传感快速测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：电化学传感阵列、酶结合物工作液、酶底物、阴性对照品、阳性对照品、样本稀释液和洗涤液；所述电化学传感阵列包括印刷碳电极、共组装在所述印刷碳电极表面的血吸虫抗原层和吸附的封闭剂层，其中，所述血吸虫抗原为日本血吸虫重组抗原SjE16和日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA的混合物；所述酶结合物工作液为含有辣根过氧化酶标记的二抗的BSA溶液；所述酶底物为四甲基联苯胺与双氧水的混合物；所述阴性对照品为正常血清；所述阳性对照品为血吸虫感染血清；所述样本稀释液和洗涤液均为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，宋世平，邓王平，冯正，胡薇，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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