本发明专利技术涉及一种用于组胺快速检测的分子印迹电化学传感方法。基于含有大量印迹孔穴的分子印迹聚合物(MIPS)建立了分子印迹膜检测组胺的电化学传感器。该材料对结构类似物无明显的交叉反应性，并且洗脱和再生20次后仍对组胺有吸附性。相对于传统的检测技术具有合成成本低、较好的稳定性、能承受极端的温度和pH环境以及良好的再生性。该传感器加入0.1M HCl溶液再生后可重复使用。最佳检测pH为8。标准曲线公式为：y＝3.440lgx+1.283，R2＝0.997，组胺的检测范围为：0.5ng/mL～50ng/mL，检测限值：0.5ng/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于组胺快速检测的分子印迹电化学传感方法，属于生物传感器检测
，制备的组胺分子印迹膜可以用于食品样品中组胺的快速检测，具有操作简便、灵敏度高、快速等优点
技术介绍
组胺(Histamine，HA)，又名组织胺，分子式：C5H9N3，化学名：4(5)-(2-氨乙基)咪唑。组氨是一种生物胺，它是由组胺酸分解而成，而组氨酸是蛋白质经过分解后产生的一种氨基酸，组胺分子量小，只有111Da，组胺分子式及结构类似物见图1，食品中组胺主要是组氨酸在莫根氏变形杆菌、组胺无色杆菌等微生物和组氨酸脱羧酶等共同作用下发生脱羧反应产生的。人体中组胺主要存储于肥大细胞和嗜碱性粒细胞中，当机体受到过敏原刺激时，会大量的产生组胺，局部浓度的增加导致过敏反应，众所周知，组胺不仅作为速发型超敏反应的一种细胞间化学介质，而且也是大脑中的神经递质，大脑中浓度达到1-6μmol/kg。组胺有毒性，可以降低血压，当有机体摄入组胺超过100mg(或每千克体重1.5mg)时，即可引起食物中毒。在由生物胺导致的食品安全问题中，组胺对人类的健康的影响最大。全国曾多次发生过组胺食物中毒事件。世界上很多国家对食品中组胺含量做了限量要求：美国FDA要求水产品中组胺含量不得超过50mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100mg/kg，其它食品中的组胺含量不得超过100～800mg/kg；我国规定鲐鱼中组胺含量不得超过100mg/100g，其它鱼类不得超过30mg/100g。据相关文献报道，组胺是一种自然产生的物质，在许多蔬菜、水果、啤酒、鱼、奶酪和红葡萄酒中都能产生组胺，为了给食品加工生产时的危害分析临界控制点(HACCP)认证提供科学依据，在食品和食品加工行业，快速、准确、可靠的检测组胺显得十分必要。组胺的检测方法主要有：有偶氮试剂比色法、荧光分光光度法、高效液相色谱法(HPLC法、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、酶联免疫方法(ELISA法)、毛细管电泳法(CE)和生物学法等。这些方法所用试剂、器皿较多，操作繁琐、费时、灵敏度低。另外，我国现行的标准检验方法是GB/T5009.45-2003和国标《水质组胺等五种生物胺的测定高效液相色谱法》(GB/T21970-2008)，目前还没有应用电化学法检测食品中组胺的标准，在国内外的文献检索中，应用电化学法检测食品中组胺的方法也很少，电化学法有操作简便、灵敏度高、快速等优点，因此建立食品中组胺的电化学法检测方法十分必要，本方法采用电化学法开展了检测组胺标准化的研究和起草工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于组胺快速检测的分子印迹电化学传感方法本专利技术的技术方案概述如下：我们在金电极上制备分子印迹膜，应用电化学进行表征，建立电化学检测组胺的方法。含有大量印迹孔穴的分子印迹聚合物(MIPs)是人工合成受体，它具有类似天然抗体或酶的特异性和选择性，这种含有合成识别元件的仿生传感器可以在各种恶劣的环境中使用。MIPs包含大量的印迹孔穴，这些孔穴能够通过形状、大小和官能团(如氢键)与靶分子进行互补，它特别适用于小分子的检测。在目标分子存在的情况下，电阻抗会发生变化，这些变化可以通过电化学传感器表征。该传感器加入0.1M HCl溶液再生后可重复使用。该电化学传感方法最佳检测pH为8。标准曲线公式为：y＝3.4401gx+1.283，R2＝0.997，组胺的检测范围为：0.5ng/mL～50ng/mL，检测限值：0.5ng/mL。相对于传统的检测技术，该方法有以下几个优点：首先，MIPs合成成本低；第二，MIPs具有较好的稳定性，能承受极端的温度和pH环境；第三，MIPs是通过非共价键的方法制备，具有良好的再生性。附图说明图1组胺及其结构类似物图2pH值对基于MIP膜的电化学传感器检测组胺的影响注：组胺的浓度为5ng/mL。图3EIS对不同浓度组胺的表征图注：a：0；b：0.5ng/mL；c：1.0ng/mL；d：2.5ng/mL；e：5.0ng/mL；f：10ng/mL；g：25ng/mL；h：50ng/mL.图4电化学传感器检测组胺的响应曲线及标准曲线图5MIP膜与NIP膜对组胺检测的选择性比较图6组胺与结构类似物的电阻抗变化的比较注：组胺浓度为5ng/mL，结构类似物为50ng/mL图7连续测定5ng/mL组胺的EIS表征图具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。实施例1：分子印迹膜的制备将金电极放入1mM的MUA乙醇溶液中反应过夜，清洗干净后，加入400mMEDC、100mM NHS混合液(1∶1，v/v)中避光振荡活化1h，然后将金电极加入含有200mM的AIBA水溶液中反应3h，反应完毕后，将金电极放入含有组胺(0.2mmol)、MAA(0.4mmol)、EGDMA(0.8mmol)及DMSO(5mL)的预聚合液中，氮气除氧10分钟后，放入60℃反应16小时，然后用甲醇/冰乙酸(9∶1，v/v)洗脱模板分子，制备得到分子印迹膜，应用这种材料检测组胺，非印迹膜的制备没有加入组胺，其它方法
同前。实施例2：金电极的处理用药匙取少量Al2O3粉于麂皮上，加少量蒸馏水润湿，将清洗干净的电极在麂皮上“8”字形打磨50次后，轻微的转动方向继续“8”字形打磨，需多次转动方向打磨，待金电极打磨光滑后，用蒸馏水冲洗，然后将金电极在1M H2SO4体系中进行清洗，循环伏安法扫描电位为-0.2～1.2V，稳定后将金电极放入0.5M H2SO4体系中进行活化，循环伏安法扫描电位为-0.2～1.6V，连续扫描20次，还原峰位于0.94V左右可认为活化完成，否则重新打磨电极，H2SO4体系实验前均用N2除氧10min。最后进行循环伏安法表征，电解液为2.5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1mol/L KCl的磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH为6.9，使用前N2除10min)，扫描电位为-0.3V～0.8V，扫描速率为100mV/s，直至出现界限明确的氧化还原峰，并且氧化还原峰电位差在100mV之内，证明该电极已达到使用标准。实施例3：电阻抗(EIS)法表征将不同梯度浓度的组胺标准液(0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50ng/mL)分别与修饰好后的金电极反应10min，每个浓度重复测量3次，绘制标准曲线，建立检测范围，计算出最低检测限值。EIS表征在含有2.5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1mol/L KCl的磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH值为6.9，使用前N2除氧10min)中进行，扫描电位为-0.3V～0.8V，扫描速率为100mV/s。实施例4：将浓度为5ng/mL的组胺溶液的pH值分别调到4-12后，再将修饰好后的金电极分别浸泡10min，然后再进行电化学表征。实施例5：精密度实验通过修饰的金电极对5ng/mL组胺进行EIS表征，洗脱和再本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在电化学传感器金电极表面制备组胺分子印迹膜的方法，其特征在于金电极处理过程由如下步骤组成：(1)用药匙取少量三氧化二铝粉于麂皮上，加少量蒸馏水润湿，将清洗干净的电极在麂皮上“8”字形打磨50次后，轻微的转动方向继续“8”字形打磨，需多次转动方向打磨，待金电极打磨光滑后，用蒸馏水冲洗，然后将金电极在1M H2SO4体系中进行清洗，循环伏安法扫描电位为‑0.2～1.2伏，稳定后将金电极放入0.5M H2SO4体系中进行活化，循环伏安法扫描电位为‑0.2～1.6伏，连续扫描20次，还原峰位于0.94伏左右活化完成。H2SO4体系实验前均用氮气除氧10min。(2)进行循环伏安法表征，电解液为2.5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1mol/L KCl的磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH为6.9，使用前氮气除10min)，扫描电位为‑0.3V～0.8V，扫描速率为100mV/s，直至出现界限明确的氧化还原峰，并且氧化还原峰电位差在100mV之内，证明达到使用标准。
【技术特征摘要】
1.一种在电化学传感器金电极表面制备组胺分子印迹膜的方法，其特征在于金电极处理过程由如下步骤组成：(1)用药匙取少量三氧化二铝粉于麂皮上，加少量蒸馏水润湿，将清洗干净的电极在麂皮上“8”字形打磨50次后，轻微的转动方向继续“8”字形打磨，需多次转动方向打磨，待金电极打磨光滑后，用蒸馏水冲洗，然后将金电极在1M H2SO4体系中进行清洗，循环伏安法扫描电位为-0.2～1.2伏，稳定后将金电极放入0.5M H2SO4体系中进行活化，循环伏安法扫描电位为-0.2～1.6伏，连续扫描20次，还原峰位于0.94伏左右活化完成。H2SO4体系实验前均用氮气除氧10min。(2)进行循环伏安法表征，电解液为2.5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1mol/L KCl的磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH为6.9，使用前氮气除10min)，扫描电位为-0.3V～0.8V，扫描速率为100mV/s，直至出现界限明确的氧化还原峰，并且氧化还原峰电位差在100mV之内，证明达到使用标准。2.一种组胺分子印迹膜的制备方法，其特征由如下步骤组成：(1)将金电极放入1mM的MUA乙醇溶液中反应过夜，清...
【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，宁保安，孙思明，彭媛，白家磊，姜随意，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。