本发明专利技术公开了一种发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的方法，属于生物技术领域。本方法的主要步骤为：菌株发酵获得粗提液，后采用离子交换层析、脱色、超滤、乙醇沉淀等技术制备获得ε-聚-L-赖氨酸成品，经检测其纯度达到98％以上，产品收率高于75％。本发明专利技术采用微生物发酵法制备ε-聚-L-赖氨酸的工艺，具有能耗低、设备结构简洁紧凑、方法易行、操作安全方便等特点，易于进行产业化推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别是涉及到一种发酵法制备ε -聚-L-赖氨酸的方法。
技术介绍
1977 年日本科学家 Shima 和 SaKai 在白色链霉菌(Streptomyces albulus 346)发酵液中首先发现ε -聚-L-赖氨酸(简称ε -PL)。ε -PL是赖氨酸位上羰基和e位氨基结合的产物，它带正电荷，阴离子物质可与其结合，没有固定的熔点，250°C以上开始软化分解；成品为淡黄色粉末、吸湿性强、略有苦味，溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂；热稳定性高，120°C加热IOmin仍具有抑菌活性，遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可因结合而使活性降低，与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用有增效作用。ε -PL是含有25 30个赖氨酸残基的阳离子聚合多肽，当聚合度低于十肽时，会丧失抑菌活性。分子量在3600 4300之间的ε-PL具有高抑菌活性。l、e-PL的功能及应用(I) ε -PL 的抑菌性ε -PL的抑菌机理可能是因为它是阳离子表面活性物质，它能破坏微生物的细胞膜结构，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，还能与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成，最终导致细胞死亡。ε -PL对细菌、真菌、酵母的最低抑制浓度不同，原因可能是它们细胞表面结构不同。ε -PL 既可以抑制革兰氏阳性菌生长又可以抑制革兰氏阴性菌生长，如革兰氏阳性菌中枯草芽孢杆菌、耐热脂肪芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中大肠杆菌、产气节杆菌等引起食物中毒和腐败菌，ε-PL对其都有强烈的抑制作用。刘慧等研究表明:ε-PL对革兰氏阳性微球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌及酵母菌生长有明显抑菌效果，ε -PL与醋酸复合试剂对枯草芽孢杆菌有明显抑制作用。Shima等采用Escherichia coli K-12研究了 ε-PL的分子量与抑菌性的关系，结果表明超过9个ε -赖氨酸残基才可以抑制微生物的生长，而化学改性a氨基会降低抑菌活性。ε -PL是一种阳离子聚合物，等电点是9.0,因此，在碱性的情况下，抑菌活性和抗噬菌体的活性是最低的。对于Ε.coli,在pH值5.0 8.0的时候,最低抑制浓度是25g/mL 50g/mL,而在pH值8.0时的最低抑制浓度大于200g/mL。同样的,如果存在像偏磷酸这种阴离子聚合物，也会降低ε-PL的抑菌活性，其原因ε-PL损失了阳离子电荷。(2) ε -PL 的应用①ε-PL在食品中的应用ε -PL是一种天然防腐剂，而且还是人体必需氨基酸-赖氨酸的聚合物，主要是作为食品添加剂应用于食品保鲜上。Neda等对ε-PL进行了毒理学研究，经慢性和亚急性喂饲小鼠实验证明了 ε-PL没有毒性，甚至当ε-PL达到高剂量水平时也不会产生任何的不利效果或基因突变。此外，ε-PL对生殖系统、神经系统、免疫系统，以及胚胎的发育、后代的生长，甚至第二代的胚胎发育都不会产生毒性，因此是一种安全的天然防腐剂。ε-PL作为一种新型食品防腐剂除了单独使用外，还可以与其他食品添加剂混合使用，如甘氨酸、醋、乙醇、硫胺素(VB)等，并且混合使用后可以在很大程度上提高防腐能力，还能对不同类型食品起到保鲜作用。例如当ε-PL和甘氨酸混合用于浓缩牛奶的保鲜防腐时，会产生明显的协同增效作用，大大提高了抑菌能力。由于这种协同作用使得食品中的防腐剂添加量得以减少。徐红华等通过饱和试验研究了 ε -PL和甘氨酸在牛奶中的保鲜作用，结果发现单独使用ε-PL和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者混合使用效果。当采用420mg/Le_PL和质量分数2 %甘氨酸配合使用时，抑菌效果最佳，可以保存I ld，还发现ε -PL和其他天然抑菌剂配合使用，也有明显的协同增效作用。②ε-PL在医学方面的应用ε-PL含有阳离子，与带有阴离子物质间有很强的静电作用力，并且对生物膜有良好的穿透力，因此ε -PL可以作为某些药物载体，在医疗和制药方面得到广泛应用。Sospedra等用以ε-PL为主链的分支聚合蛋白搭载生物大分子治疗肝炎病毒，取得良好疗效。Diederich等研究了电脉冲对不同分子量ε -PL修饰细胞膜的破坏程度，发现细胞膜吸附高分子量ε-PL会降低其破坏I临界电压。另外，在基因治疗、在基因芯片的制造(核酸生物芯片、氣基酸芯片、蛋白质芯片等)和某些药物的包装物制作等方面均有重要用途。2、ε-PL国内外研究现状(I) ε -聚-L-赖氨酸产生菌的分离筛选20世纪70年代末，Shima等首次从白色链霉菌(Steptomyces albulus)的发酵液中发现ε-PL。藤井正弘等 发现诺尔斯氏链霉菌(Steptomyces noursei)也可产生PL。Sz0kdin等发现一种丝状的麦角真菌(Claviceps purpurea)能够积累一种类似PL、含有大量赖氨酸的化合物-麦角胺(clavicepamines)，其化学结构与S.albulus的产物不同。从20世纪90年代末至今，筛选ε-PL高产菌株一直是研究的热点。2002年，日本学者Nishikawa等找到了一种有效的筛选方法，通过在培养基中加入一种酸性染料POLY R-478，可以在ε-PL产生菌的菌落周围看到明显的颜色浓缩圈，因而可以进行大规模筛选，克服了盲目性。Nishikawa采用这种方法，对日本各地土壤样品进行了大规模的筛选，获得了许多可以产生ε-PL的菌株，发现大多数ε-PL产生菌集中在链霉菌科(Streptomycetaceae)的几个不同的属和麦角真菌(ergot fungi)这两类微生物上，且不同菌株的产物其赖氨酸单体数也有所不同(n = 10 36，10 24，8 9)，并且发现这些菌株大部分属于链霉菌。但由于P0LYR-478现已停产，菌株筛选又变得较困难。中国学者王晓丹等、张超等、朱宏阳等采用碱性染料亚甲基蓝，先后分离到了产ε-PL的菌株，但由于亚甲蓝对微生物毒性较高，而且出菌率较低，分离到的菌株均为放线菌，菌种单一，ε -PL产量较低。因此探索筛选培养基指示剂，研究建立高通量、高分辨、高灵敏e-PL产生菌筛选模型是目前ε-PL研究的难点之一。(2) ε -聚-L-赖氨酸发酵工艺研究现状采用Shima等分离的白色链霉菌变种，聚赖氮酸发酵产量为0.5g.T10 ε -PL产生菌株的摇瓶批式发酵产量较低，均在0.2 1.0g.L'岩田敏治等以Β21021菌株为研究对象，在3L发酵罐中采用氨水调控pH，补加葡萄糖和硫酸铵，发酵培养72h时，ε -PL产率为16.2g.L—1，而发酵培养168h时产率为31g.L—1，产率有了较大幅度的提高。Hiraki等以野生白色链霉菌S.albulus346为出发菌株，经诱变获得了抗S- (2_氨乙基)-L-半胱氨酸与甘氨酸的突变株并且90%为高产菌株，其中I株在试管发酵最高产量为2.1lmg.πιΓ1，比野生菌株高了 10倍，这株菌对天冬酰胺激酶有很高的特异性。在3L发酵罐中，120h产率Kahar等报道pH与葡萄糖对ε-PL发酵产量有很大的影响。发酵分两个阶段，PH高于5.0有利于菌体生长，而pH低于4.0对产ε-PL是关键。通过发酵控制，ε -PL的产量由起初的g.Γ1增长到48本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发酵法制备ε?聚?L?赖氨酸的方法，其特征是发酵菌株为白色链霉菌(Streptomyces?albus)CQ0723，其菌种保藏编号为CGMCC?No.6409。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王秀英，
申请(专利权)人：四川金稞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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