用于生产莫纳甜和其前体的多肽和生物合成途径制造技术

本文提供了可用于由葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸制备莫纳甜的方法和组合物。也公开了生产吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中间体的方法。所提供的组合物含有核酸分子、多肽、化学结构和细胞。方法包括体外和体内方法，体外方法包括化学反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了可用于生产吲哚-3-丙酮酸、2-羟基2_(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)和/或莫纳甜的多肽和生物合成途径。
技术介绍
吲哚丙酮酸吲哚-3-丙酮酸是一种强效抗氧化剂，相信它抵消了氧气浓度高的组织中的氧化应激(Politi 等色氨酸研究的最近进展”(Recent advances in Tryptophan research),G.A.Filippini等编,普利诺出版社(Plenum Press),纽约，1996,第291-8页)。卩引哚丙酮酸也是作为主要的植物生长激素生长素(可扩散的生长促进因子)的吲哚-乙酸(IAA)的产生途径中的中间物。在生理过程包括顶端优势、向性、纸条伸长、诱导形成层细胞分裂和生根中，亚微克量的IAA是有活性的。园艺中用合成生长素诱导生根并促进果实形成和发育。在高浓度时，合成生长素是有效的阔叶植物除草剂。可认为，通过发酵生产的天然生长素比化学生产的除草剂对环境更友好。1999年生长调节剂的全球销售额为4亿英镑(14亿美兀)。关于吲哚乙酸和其 衍生物的专利的一些例子包括:美国专利5，843，782 “蔷薇科植物的微体繁殖，用于培养基的生长素(Micropropagation of rose plants, auxin usedinculture medium) ”和美国专利5，952，231 “蔷薇科植物的微体繁殖(Micropropagationofrose plants)”。除了植物相关用途以夕卜，吲哚乙酸还用于药物应用。例如，美国专利号5，173，497 “ α -氧代吡咯并[2，3-Β]吲哚乙酸和衍生物的制备方法(方法preparingalpha-oxopyrrolo [2, 3-B] indole acetic acids and derivatives)，，提出，用这些化合物治疗记忆损伤，如伴随阿尔茨海默病和老年性痴呆的记忆损伤。美国专利号5，173,497中提出的机制是这些化合物抑制乙酰胆碱酯酶并提高大脑中的乙酰胆碱水平。通过过氧化物酶催化的氧化作用由吲哚-3-乙酸产生吲哚-3-甲醇，且可容易地转化成二吲哚甲烷。据报道，两种化合物能够消除毒素并促进产生有益于女性健康的激素。色氨酸衍生物氯化D-色氨酸被鉴定为非营养性甜味剂，对探索其它衍生物的兴趣持续增加。 莫纳甜是组成类似于氨基酸色氨酸的天然甜味剂。它可提取自南非灌木似冬青叶硬木朔(Sclerochiton ilicifolius)的根皮，作为高强度甜味剂在食品和饮料工业中有前途。关于莫纳甜的专利的一些例子包括:美国专利号5，994，559 “合成莫纳甜-高强度天然舌甘味剂，，(Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener);美国专利号 4，975，298 3-(1-氨基-1, 3- 二羧基-3-羟基-丁 -4-基)_ 吲哚化合物” (3-(l_amino-l, 3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-1ndole compounds);美国专利号 5, 128, 164 “含有3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)-吲哚化合物的供人类消费的组合物，，(Compositionfor human consumption containing3- (1-amino-l, 3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) -1ndolecompounds)和美国专利号 5, 128, 482 “生产 3-1 (1-氨基-1, 3- 二羧基-3-轻基-丁-4-基)口引哚的方法”(Process for the production of3_l (1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)indole)。本文所述的一些莫纳甜前体也可用作合成甜味剂或合成莫纳甜衍生物的中间体。专利技术概述本专利技术提供了由葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或通过莫纳甜前体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸制备莫纳甜的几种生物合成途径。公开了可用于制备莫纳甜、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的多肽和核酸序列。为了简明，无论在说明书和权利要求书中的什么地方提到形成的中间体/产物(如莫纳甜或莫纳甜前体)，只要合理均可包含术语“和/或其盐”。换言之，例如，术语“将吲哚-3-丙酮酸转变为莫纳甜前体”应理解为“将吲哚-3-丙酮酸转变为莫纳甜前体和和/或其盐”。实际上，本领域普通技术人员应理解，在所示的反应条件下，实际上存在或也存在中间体/产物的盐。可通过包含一种或多种合适底物和一种或多种所选多肽的反应混合物发生反应来生产莫纳甜。合适底物可包括但不限于:葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、莫纳甜前体(如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸)和其混合物。可将用于生产莫纳甜的反应混合物中存在的合适底物加入反应混合物和/或可以在反应混合物中原位生产所述合适底物。可将所选多肽加入反应混合物中和/或可以由反应混合物中存在的微生物生产(例如用表达所选多肽的微生物发酵该反应混合物)。可通过吲哚-3-丙酮酸、2-羟基2_(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸(莫纳甜前体，MP，莫纳甜的α酮形式)、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖来产生莫纳甜(附图说明图1)。产生或制造莫纳甜或其中间体的方法见图1-3和11-13，包括将底物转化为第一种产物，然后将第一种产物转化为第二种产物，等等，直到产生所需终产物。图1-3和11-13在方框中显示了可能的中间产物和终产物。例如，可用这些方法进行一种产物到另一种产物的转化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到ΜΡ、ΜΡ到莫纳甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。可用化学方法或生物学方法促进这些转化。术语“转化”指在将第一种中间体转变成第二种中间体的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转化”指不由多肽主动促进的反应。术语“生物转化”指由多肽(如酶)主动促进的反应。转化可在体内或体外发生(如用合适微生物发酵营养肉汤)。当使用生物转化时，多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物上。可用本领域普通技术人员已知的任何反应器，例如在分批或连续反应器中完成转化。 也提供了方法，包括使第一种多肽接触底物，制造第一种产物，然后使产生的第一种产物接触第二种多肽，产生第二种产物，然后使产生的第二种产物接触第三种多肽，产生第三种产物，例如莫纳甜。所用多肽和所产生的产物见图1-3和11-13。公开了可用于进行图1-3和11-13中所示转化的多肽及其编码序列。在一些实施例中，具有一个或多个改变多肽的底物特异性和/或活性的点突变的多肽可用来制造莫纳甜。公开了产生莫纳甜的分离和重组细胞。这些细胞可以是任何细胞，如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。这些细胞可用于通过发酵含有该细胞的营养培养基合成莫纳甜。所述营养培养基可包含用于合成莫纳甜的任何合适分子，包括但不限于:葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或莫纳甜前体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产莫纳甜的方法，包括将色氨酸和/或吲哚?3?乳酸转化为莫纳甜，所述方法包括：将色氨酸或吲哚?3?乳酸与第一多肽接触，所述第一多肽将色氨酸或吲哚?3?乳酸转化为吲哚?3?丙酮酸；将吲哚?3?丙酮酸与第二多肽和C3碳源接触，所述第二多肽将吲哚?3?丙酮酸与所述C3碳源转化为2?羟基2?(吲哚?3?基甲基)?4?酮戊二酸；和将2?羟基2?(吲哚?3?基甲基)?4?酮戊二酸与第三多肽接触，所述第三多肽将2?羟基2?(吲哚?3?基甲基)?4?酮戊二酸转化为莫纳甜。

【技术特征摘要】
2005.04.26 US 11/114,9221.一种生产莫纳甜的方法，包括将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转化为莫纳甜，所述方法包括: 将色氨酸或吲哚-3-乳酸与第一多肽接触，所述第一多肽将色氨酸或吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸； 将吲哚-3-丙酮酸与第二多肽和C3碳源接触，所述第二多肽将吲哚-3-丙酮酸与所述C3碳源转化为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和 将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸与第三多肽接触，所述第三多肽将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转化为莫纳甜。2.如权利要求1所述的方法，所述第一多肽 a)选自:色氨酸转氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.28)、多底物转氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)、D_氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D_色氨酸转氨酶、D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、及其组合，所述第一多肽将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸； b)选自:吲哚乳酸脱氢酶(EC1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC1.1.1.111)和乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)或其组合，所述第一多肽将吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸； c)包含 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登录号:NP_388848.UGenbank 登录号:ΖΡ00005082.1或Genbank登录号:AAC74014.1中所示氨基酸序列； d)包含与SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登录号:ΝΡ_388848.1、Genbank登录号:ΖΡ00005082.1或Genbank登录号:AAC74014.1中所示序列至少90%相同的氨基酸序列； e)包含与SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、32、Genbank 登录号:ΝΡ_388848.1、Genbank登录号:ΖΡ00005082.1或Genbank登录号:AAC74014.1相比区别不到50个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述氨基酸序列将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸；或者 f)包含氨基酸氧化酶(EC1.4.3.-)或过氧化氢酶(EC1.11.1.6)，并将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸。3.如权利要求1所述的方法，所述第二多肽a)是EC4.1.2.-酶或 EC4.1.3.-酶; b)包含SEQ ID NO:66、Genbank 登录号:CAC46344、Genbank 登录号:CAB14127.1、Genbank登录号:AAC74920.1或Genbank登录号:CAC47463.1中所不氨基酸序列； c)包含与SEQ ID NO:66、Genbank 登录号:CAC46344、Genbank 登录号:CAB14127.1、Genbank登录号:AAC74920.1或Genbank登录号:CAC47463.1至少90%相同的氨基酸序列；或 d)包含与SEQ ID NO:66、Genbank 登录号:CAC46344、Genbank 登录号:CAB14127.1、Genbank登录号:AAC74920.1或Genbank登录号:CAC47463.1相比区别不到50个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述氨基酸序列将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸转化为MP。4.如权利要求1所述的方法，所述第三多肽 a)选自:酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶(EC2.6.1.5)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸转氨酶(EC2.6.1.27)、天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)、D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)、D-色氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、多底物转氨酶(EC2.6.1._)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)及其组合； b)包含SEQ ID N0:2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·M·西克斯，S·C·麦克法兰，
申请(专利权)人：嘉吉有限公司，
类型：发明
国别省市：