一次性发酵制备高纯度赖氨酸硫酸盐的方法技术

本发明专利技术提供了发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括向产L-赖氨酸的菌导入一个被认为与赖氨酸代谢无关的基因，而且产品中赖氨酸含量达到了市售产品的纯度。另外，本发明专利技术还提供了所述方法生产的产品，该产品相对于现有含L-赖氨酸硫酸盐的产品，能够显著提高抗吸湿性，从而适宜长期保存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括创新地向产L-赖氨酸的菌导入一个通常被认为与赖氨酸代谢无关的基因，而且产品中赖氨酸含量达到了市售产品的纯度。另外，本专利技术还提供了所述方法生产的产品和应用等。
技术介绍
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中，尤其是含有杂质的赖氨酸盐(如，硫酸盐、盐酸盐)，一般也可以直接作为饲料添加剂使用。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。 在赖氨酸盐的各类产品中，尤其是赖氨酸硫酸盐，具有非常大的缺点，即具有较大的吸湿性，由此使得其中的含水量过高(如，大于3% )，这样过高的产品湿度容易导致产品结块，不易保存，尤其长期保存时容易发霉，这即使在作为安全要求较低的饲料使用时，也是不容许的。尤其是本专利技术人发现，我国广大农户，牲畜饲养规模不大，赖氨酸盐作为饲料添加剂用量不大，因此整包购进(往往单价更为便宜)的赖氨酸盐产品，因此会有较多留存，长期保存时产品的吸湿性对他们的影响更大。为此，日本味之素公司采用调节酸根阴离子与赖氨酸的当量比来克服这一缺陷，将酸根阴离子与赖氨酸的当量比调节为O. 68 O. 95之间，即酸根阴离子的当量小于赖氨酸的当量，这样可以在一定程度上降低产品的平衡湿度(参见中国专利第03120099号)。上述方法对于赖氨酸盐酸盐来说，会带来比较良好的抗吸湿性，在相对湿度为33 58%的常规保存环境下，基本能使得产品的平衡湿度控制在3%以下；然而，对于赖氨酸硫酸盐来说，在此保存环境下，平衡湿度基本都会超过3%，甚至会超过5%。经本专利技术人长期研究和实验，令人意外地发现了，在抗吸湿性差的赖氨酸硫酸盐中添加一定比例的其它类型的氨基酸，尽管会降低产品中赖氨酸硫酸盐的纯度，但是会使得赖氨酸硫酸盐产品的抗吸湿性得到显著提升，而且该纯度的产品并不影响其作为赖氨酸饲料添加剂的效用。而且，本专利技术人还研究出了一种新的发酵方法，与现有技术的不断加强生成赖氨酸的代谢途径的思路相反，打开非赖氨酸代谢的其他旁路，尤其是在十分复杂的代谢通路中令人意外地寻找到了一种酶，打开的程度非常适中，从而能一次性发酵得到赖氨酸和其它类型氨基酸配比适当的产品，无需过多的制备工艺步骤，得到的产品仍旧能够作为赖氨酸饲料添加剂，而且抗吸湿性得到显著提升。进一步地，本专利技术人发现，在该一次性发酵所得到的产物中的赖氨酸含量在添加了硫酸成盐后很难逾越55%，而目前市场上销售的产品中以高浓度产品为主(一般赖氨酸含量为55%或以上)，因此将产品中赖氨酸含量提升到至少55%，才能比较容易进行市场推广。为此，本专利技术人还提供了一种步骤简便的发酵生产高纯度赖氨酸硫酸盐的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括创新地向产L-赖氨酸的菌导入一个通常被认为与赖氨酸代谢无关的基因。另夕卜，本专利技术还提供了该方法生产的产品和应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括(I)将编码氨基酸序列如SEQ ID No :1所示的蛋白或其变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌；(2)在发酵条件下液体培养步骤(I)获得的菌，收集培养的上清液，并让该上清液通过滤膜，保留滤液，所述滤液中包含如下重量配比的氨基酸赖氨酸54 60份,优选为55 57份,更优选为55. 7份；·天冬氨酸I. 3 I. 9份，优选为I. 5 I. 65份，更优选为I. 61份；苏氨酸O. 8 I. 2份，优选为O. 9 I. I份，更优选为I份；丝氨酸O. 45 O. 7份,优选为O. 55 O. 65份，更优选为O. 6份；谷氨酸2 3份，优选为2. 3 2. 8份，更优选为2. 56份；甘氨酸O. 8 I. I份，优选为O. 85 I. 05份，更优选为O. 96份；丙氨酸I. 3 I. 7份，优选为I. 4 I. 6份，更优选为I. 5份；缬氨酸O. 8 I. 2份，优选为O. 9 I. I份，更优选为O. 99份；甲硫氨酸O. 35 O. 55份，优选为O. 4 O. 5份，更优选为O. 44份；异亮氨酸O. 5 O. 8份,优选为O. 6 O. 7份,更优选为O. 63份；亮氨酸I. I I. 6份，优选为I. 25 I. 45份，更优选为I. 36份；酪氨酸O. 55 O. 9份，优选为O. 65 O. 8份，更优选为O. 72份；苯丙氨酸O. 5 O. 85份，优选为O. 6 O. 75份，更优选为O. 67份；组氨酸O. 8 I. 2份，优选为O. 9 I. I份，更优选为I. 02份；和，精氨酸，I I. 5份，优选为I. I I. 3份，更优选为I. 18份；(3)向步骤⑵获得的滤液，加入硫酸并浓缩干燥至含水率小于3% (w/w)。在本专利技术的具体实施方式中，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID No:l所示的蛋白。与现有技术的不断加强生成赖氨酸的代谢途径的思路相反，本专利技术第一方面的方法通过引入RNA聚合酶sigma-32因子来适中地打开非赖氨酸代谢的其他旁路，从而能一次性发酵得到赖氨酸和其它类型氨基酸配比适当的产品，无需过多的制备工艺步骤。RNA聚合酶sigma-32因子通过特异性地对热休克启动子起作用，而参与热休克过程，影响热休克相关蛋白的转录，从而对谷氨酸发酵中的微生物克服代谢产生的毒物产生影响。尽管RNA聚合酶sigma-32因子已经被公开(可参见NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登录号AAB18436. I ;也可参见中国专利申请第96193336号)，但是RNA聚合酶sigma-32对赖氨酸发酵以及对其中的氨基酸产生分布的影响却没有任何启示。因此，优选在本专利技术第一方面的方法中，所述变体的氨基酸序列为对如SEQ ID No :I所示的氨基酸序列添加、缺失或取代一个和几个氨基酸残基而获得的氨基酸序列。更优选在本专利技术第一方面的方法中，所述变体的氨基酸序列为对如SEQ IDNo 1所示的氨基酸序列添加、缺失或取代一个和几个氨基酸残基而获得的氨基酸序列，而且编码该变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌后在发酵条件下液体培养,培养的上清液包含如本专利技术第一方面中所述重量配比的氨基酸。本领域技术人员可以根据RNA聚合酶sigma-32因子的氨基酸序列推导出其编码的核苷酸序列，优选是密码子改造的核苷酸序列，以调节该代谢途径打开的程度。在本专利技术的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所不。所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述RNA聚合酶sigma-32因子即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒等载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本专利技术第一方面的方法中，工程菌是大肠杆菌，更优选是对L-赖氨酸反馈抑制脱敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
发酵制备含L？赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括：(1)将编码氨基酸序列如SEQ？ID？No：1所示的蛋白或其变体的多核苷酸导入产L？赖氨酸的菌；(2)在发酵条件下液体培养步骤(1)获得的菌，收集培养的上清液，并让该上清液通过滤膜，保留滤液，所述滤液中包含如下重量配比的氨基酸：赖氨酸54～60份，优选为55～57份，更优选为55.7份；天冬氨酸1.3～1.9份，优选为1.5～1.65份，更优选为1.61份；苏氨酸0.8～1.2份，优选为0.9～1.1份，更优选为1份；丝氨酸0.45～0.7份，优选为0.55～0.65份，更优选为0.6份；谷氨酸2～3份，优选为2.3～2.8份，更优选为2.56份；甘氨酸0.8～1.1份，优选为0.85～1.05份，更优选为0.96份；丙氨酸1.3～1.7份，优选为1.4～1.6份，更优选为1.5份；缬氨酸0.8～1.2份，优选为0.9～1.1份，更优选为0.99份；甲硫氨酸0.35～0.55份，优选为0.4～0.5份，更优选为0.44份；异亮氨酸0.5～0.8份，优选为0.6～0.7份，更优选为0.63份；亮氨酸1.1～1.6份，优选为1.25～1.45份，更优选为1.36份；酪氨酸0.55～0.9份，优选为0.65～0.8份，更优选为0.72份；苯丙氨酸0.5～0.85份，优选为0.6～0.75份，更优选为0.67份；组氨酸0.8～1.2份，优选为0.9～1.1份，更优选为1.02份；和，精氨酸，1～1.5份，优选为1.1～1.3份，更优选为1.18份；(3)向步骤(2)获得的滤液，加入硫酸并浓缩干燥至含水率小于3％(w/w)。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马吉银，陈崇安，孟刚，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：