本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种利用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中分离提取高纯度雷莫拉宁的方法。本发明专利技术采用纳滤浓缩纯化技术处理了发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液，延长了离子交换树脂的使用寿命，大大减少了溶剂及硅胶的用量，降低了蒸发能耗，产品收率最高可达９０％，产品纯度最高可达９０％。本发明专利技术所提供的工艺步骤简单，成本低，适合工业生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及抗生素雷莫拉宁的分离提取方法，尤其涉 及一种利用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中分离提取高纯度雷莫拉宁的方法。
技术介绍
雷莫 拉宁((Ramoplanin，A-16686，MDL6)属于新型广谱抗革兰氏阳性菌抗生素，对葡萄球菌、链球菌、放线菌、棒状杆菌、梭菌、乳杆菌等多种菌属都具有很强的 抗菌活性。对于甲氧西林耐受株或是敏感株，雷莫拉宁的MIC90均小于甲氧西林、万古 霉素和替考拉宁.显示了雷莫拉宁良好的抗菌活性。雷莫拉宁的作用机制在于能特异地 抑制细胞壁上肽聚糖的生物合成，但这种抑制方式与万古霉素及替考拉宁的抑菌机制不 同。雷莫拉宁于2004 年由 Genome Therapeutics(Oscinet Pharmaceuticals)公司向美国FDA提出申请并获得快速审批，其适应证为用于治疗梭状芽胞杆菌引起的痢疾。除了该 适应症外，雷莫拉宁还正在进行其他项目的临床研究，如用于口服治疗癌症病人VRE引 起的血液感染的III期临床实验。另外，一些开发公司还在考虑考雷莫拉宁的局部应用 适应症，包括革兰阳性菌引起的皮肤感染或防止易感人群由鼻腔吸人金黄色葡萄球菌感^fe ο1981年意大利的Burno等从ATCC33076的培养物中分离得到一抗菌活性物质 A-16686，并申请了专利US 4303646。1983年，Burno等又对A-16686进行进一步分离纯化得到三个组分，分别称作雷莫拉宁Ap雷莫拉宁A2、雷莫拉宁A3,其中雷莫拉宁A2 为主要组分，申请专利US 4427656。雷莫拉宁提纯的传统方法是通过常规前处理步骤用盐酸将产生雷莫拉宁的菌 株，如Actinoplimessp.ATCC33076的发酵产物调pH至3.5，分离得到菌丝体和发酵 液。其中菌丝体用有机溶剂，如甲醇等低级醇或氯仿等提取，得到含有目的物的粗提 液，真空浓缩得到浆状物，即雷莫拉宁的粗提液浓缩物，再用正丁醇萃取多次，合并萃 取液后，再反复用石油醚析出沉淀并分离其，真空干燥得到的粗品；而发酵液也用正丁 醇萃取，然后用同样方法制得粗品。该粗品反复用混合溶剂氯仿乙醇水(体积比为 4:7:2)处理，得到油状物，加水结晶并固液分离，得到的固体和液体还需不同溶剂 多步处理后，得到较纯的粗品再湿法上硅胶柱纯化；例如上述的固体用不同的有机溶剂 (如甲醇、正丁醇、乙醚等)反复处理，得到较纯的粗品后再溶于乙腈与水的混合物，然 后湿法上硅胶柱，用不同溶剂(乙腈与水混合物，以及乙腈与0.1N盐酸混合物)作为流 动相洗柱子，用薄层色谱法检测，收集目的洗脱液(US 4328316)。可见其过程复杂，有 机溶剂使用量很大，污染严重，且由于萃取次数多，造成损失而收率低。专利CN 101024662A为了克服上述技术的缺陷，提供了一种步骤简化、明显减 少有机溶剂使用量的雷莫拉宁的纯化方法。该法包括将雷莫拉宁粗提液浓缩物先与部分 硅胶混合，挥干溶剂，在将得到的固体混合物置于以硅胶为填充物的柱子上端进行柱层析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相。虽然该法简 化了工艺步骤、减少了有机溶剂的使用量，但是仍然存在一些问题。例如，该工艺仍采 用传统的减压浓缩的方法获得粗体液浓缩物，需要的蒸发能耗较高，且产品可能由于在 蒸发过程中温度的升高而变性；该工艺直接将粗提液浓缩干法上硅胶柱，由于粗体液浓 缩物中含有大量的无机盐、色素、糖类和蛋白质，因此有效上样量少，硅胶及洗脱剂用 量大，不利于工业化生产。膜分离技 术是一项新兴的分离技术，自从60年代开始大规模工业化应用以来， 发展十分迅速，其产品日益丰富，被认为是20世纪末到21世纪初最有发展前途的高技术 之一。它是用天然或人工合成的高分子膜以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或 多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法。此技术具有分离效率高、分 离条件温和、流程简单及能耗较低，及它的规模和处理能力可在很大范围内变化，而它 的效率、设备单价、运行费用等都变化不大的优点，因此在发酵产品的分离和精制等方 面应用广泛。常用的膜分离技术包括微滤、超滤、电渗析、反渗透、纳滤等。纳滤是膜分离过程的一个新兴领域，其分离性能介于反渗透和超滤之间，是近 年来国际上发展较快的膜品种之一。纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右，其截留相对分 子量通常为200 3000道尔顿，在压力驱动下允许一些无机盐和小分子有机物透过膜， 既能是大分子有机物和小分子有机物分离，也能使用有机物和无机盐分离兼使有机物浓 缩。纳滤膜特有的功能是反渗透和超滤膜无法取代的。目前纳滤浓缩纯化技术已成功地 在水处理和生化分离领域实现了工业化应用，还可望在生物、纺织等行业得到应用。在 国内，应用纳滤技术进行雷莫拉宁的分离纯化还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种利用纳滤浓缩纯化技术 从发酵液中分离纯化雷莫拉宁的方法，该方法具有条件温和，操作简单，分离步骤少， 选择性好的特点，克服了现有技术中操作步骤复杂、有机溶剂及硅胶用量大、浓缩步骤 能耗较高的缺点，并且使雷莫拉宁收率和质量显著提高。本专利技术提供的利用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中分离雷莫拉宁的基本步骤是 1)发酵粗提液经过滤后，采用纳滤分离技术进行浓缩纯化得浓缩液；2)用离子交换树脂 处理浓缩液，再用去离子水冲洗树脂，用碱液解析得洗脱液；3)采用纳滤分离技术进行 浓缩纯化洗脱液，得离子交换浓缩洗脱液；4)离子交换浓缩洗脱液湿法上硅胶柱，依次 采用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相进行柱色谱分离纯化，得 柱层析洗脱液；5)采用纳滤分离技术浓缩纯化柱层析洗脱液，得到浓缩所洗脱液；6)浓 缩液静置，产品结晶，过滤，得到雷莫拉宁产品。其中所使用的纳滤膜为聚酰胺膜、聚醚砜膜、醋酸纤维素膜、磺化聚醚砜膜、 磺化聚砜膜或聚乙烯醇膜。纳滤膜分子截留在500 2400，优选1500 2400，更优选 2000 ；应用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的操作压力在0.1 IMPa,操作温度20 45°C ；优选操作压力0.8MPa，优选操作温度为常温；与现有工艺技术相比，利用本专利技术的方法所具有的优越性如下1)本专利技术采用纳滤浓缩纯化技术使发酵液中的离子性杂质和色素大量去除，减 少了对离子交换树脂的污染，大大延长了离子交换树脂的使用寿命，减少了排污量。2)本专利技术采用纳滤浓缩纯化技术使发酵液中的离子性杂质和色素大量去除，强 化了柱层析的分离效果，并大大减少了柱层析中硅胶及有机溶剂的使用量，减少了环境 污染。3)本专利技术工艺采用纳滤浓缩纯化技术处理发酵液、离子交换洗脱液、柱层析洗 脱液，大大减少了蒸发能耗，降低了生产成本。4)本专利技术工艺最突出的优越性体现在精制后的雷莫拉宁质量显著提高，经纳滤 浓缩纯化、离子交换、柱层析、溶媒结晶等工艺得到的雷莫拉宁经高效液相色谱(HPLC) 分析纯度可高达90%以上。附图说明附图为采用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提 液中制取雷莫拉宁的流程示意图。 具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术并不受其限制。下面实施例中所用的雷莫拉宁的粗提液选用下列步骤制得参照现有技术，如 上述美国专利文献(US 43本文档来自技高网...
【技术保护点】
采用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的方法，其特征在于通过纳滤浓缩纯化技术处理发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液，制备高纯度雷莫拉宁产品，具体步骤为：１）发酵粗提液经过滤后，采用纳滤分离技术进行浓缩纯化得浓缩液；２）用离子交换树脂处理浓缩液，再用去离子水冲洗树脂，用碱液解析得洗脱液；３）采用纳滤分离技术进行浓缩纯化洗脱液，得离子交换洗脱液浓缩液；４）离子交换洗脱液浓缩液湿法上硅胶柱，依次采用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相进行柱色谱分离纯化，得柱层析洗脱液；５）采用纳滤分离技术浓缩纯化柱层析洗脱液，得到浓缩所洗脱液；６）浓缩液静置，产品结晶，过滤，得到雷莫拉宁产品。
【技术特征摘要】
1.采用纳滤浓缩纯化技术从发酵粗提液中制取雷莫拉宁的方法，其特征在于通过纳 滤浓缩纯化技术处理发酵粗提液、离子交换洗脱液和柱层析洗脱液，制备高纯度雷莫拉 宁产品，具体步骤为1)发酵粗提液经过滤后，采用纳滤分离技术进行浓缩纯化得浓缩液；2)用离子交换树脂处理浓缩液，再用去离子水冲洗树脂，用碱液解析得洗脱液；3)采用纳滤分离技术进行浓缩纯化洗脱液，得离子交换洗脱液浓缩液；4)离子交换洗脱液浓缩液湿法上硅胶柱，依次采用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与 酸水的混合物作为流动相进行柱色谱分离纯化，得柱层析洗脱液；5)采用纳滤分离技术浓缩纯化柱层析洗脱液，得到浓缩所洗脱液；6)浓缩液...
【专利技术属性】
技术研发人员：张春颖，周青，
申请(专利权)人：四川金稞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：90
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