本发明专利技术公开了一种DNA片段及其在构建HCV全基因表达动物模型中的应用。所述DNA片段的核苷酸序列由如下序列依次串联组成：细菌四环素耐药操纵子的操纵基因序列、人类巨噬细胞的立早启动子基因序列、丙型肝炎病毒全基因组基因序列和具有在DNA和/或RNA水平上剪切丙型肝炎病毒全基因组活性的核酶的基因序列。该DNA片段可用于构建受四环素或四环素衍生物诱导丙型肝炎病毒全基因组表达的转基因动物模型。由于该动物模型免疫正常，因而能针对HCV的表达产生特异性的抗病毒免疫反应，从而可有效应用于HCV疫苗药物评价、病毒感染的免疫病理损伤机制研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA片段及其在构建HCV全基因表达动物模型中的应用。
技术介绍
丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV)是一种嗜肝单股正链RNA病毒，基因组大小约为9.6kb，包括一个编码多聚蛋白ORF和两侧非编码区。目前全球约有1.8亿HCV感染者，大约20%患者会转变为肝硬化并进一步发展为肝癌，因而严重威胁人类健康。HCV具有高度种属特异性，仅能感染人和黑猩猩，不能自然感染小鼠，因而严重阻碍了 HCV复制及其致病机制研究以及疫苗、抗病毒药物的研发与评价。建立新型HCV小动物模型，对于HCV宿主易感性和复制机制、HCV感染致病机制以及针对HCV的新型预防和治疗策略研究等均具有重要意义。2005 年 Wakita 等(Wakita T, et al, Nature Medicine2005; 11，791-796)首次分离到一株可感染性2a型HCV病毒毒株JFHl。体外转录的JFHl全长RNA转染Huh_7人肝癌细胞后，可产生感染性HCV病毒颗粒，且该病毒颗粒对Huh-7细胞和黑猩猩均具有感染性。目前，HCV感染性小鼠模型是将人肝组织移植入免疫耐受或免疫缺陷鼠体内建立起的人肝嵌合HCV感染模型。由于该模型小鼠处于免疫耐受或免疫缺陷状态，因而并不能反映临床自然感染状态下宿主在感染病毒后机体免疫系统的抗病毒作用及对机体造成的免疫病理损伤。Tet-On 系统是目前较为成熟的真核生物外源基因诱导表达系统之一，它利用大肠杆菌TnlO转座子中四环素操纵子原理来实施调控外源基因在真核细胞中定量并特异地表达，具有高效、无毒、开/关较严密等特点，已被成功地应用于细胞和转基因小鼠诱导表达外源基因的研究。Tet-On系统由两部分组成:①Tet反应性元件(tetracycline responsive element, TRE),由7拷贝的细菌四环素耐药操纵子的操纵基因序列(TetO)和人类巨噬细胞的立早启动子(PminCMV)组成；②融合的转录活化因子rtTA (reverse tet-controlled transcriptional activator),是由细菌的四环素阻遏物TetR和人类单纯疱疹病毒(HSV)的毒粒蛋白VP16转录激活蛋白融合而成的一个融合蛋白，能被强力霉素(Dox)所诱导和激活，并与TetO结合，通过VP16发挥转录活性。此系统既有四环素阻遏物-操纵子相互作用的特异性，又具有VP16转录活化因子的激活潜能，它们在体外培养细胞和转基因小鼠中能使目的基因的表达提高约IO5倍(UrlingerS，Baron U，Thellmann Mj et al.Exploring the sequence space for tetracycline —dependent transcriptional activators:novel mutations yield expanded range andsensitivity.Pro Natl Acad Sci USA，2000，97:7963 — 7968)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种DNA片段及其在构建HCV全基因表达动物模型中的应用。所述DNA片段(命名为DNA片段a)的核苷酸序列可由如下序列依次串联组成:细菌四环素耐药操纵子的操纵基因序列、人类巨噬细胞的立早启动子基因序列、HCV (丙型肝炎病毒)全基因组基因序列和具有在DNA和/或RNA水平上剪切HCV全基因组活性的核酶的基因序列。该DNA片段整合入动物的基因组，被转录活化因子rtTA诱导表达后，丙型肝炎病毒全基因组可被核酶剪切下来，获得具HCV感染性的动物模型。在上述DNA片段中，所述细菌四环素耐药操纵子的操纵基因序列具体可为序列表序列I的第7位至第300位序列；和/或，所述人类巨噬细胞的立早启动子基因序列具体可为序列表序列I的第301位至第438位序列；和/或，所述丙型肝炎病毒全基因组基因序列可根据实际研究目标的不同选择不同HCV毒株的全基因组序列，本专利技术实施例选择的毒株为2a型HCV病毒毒株JFHl，其全基因组序列为序列表序列I的第486位至第10220位序列；和/或，所述具有在DNA和/或RNA水平上剪切HCV全基因组活性的核酶的基因序列可为丁型肝炎病毒核酶基因序列，具体可为序列表序列I的第10221位至第10308位序列。所述DNA片段(命名为DNA片段b)的核苷酸序列还可为在所述DNA片段a的核苷酸序列中的人类巨噬细胞的立早启动子基因序列和丙型肝炎病毒全基因组基因序列间插入序列表序列I的第439位至第485位序列后形成的序列。所述DNA片段(命名为DNA片段c)的核苷酸序列还可由如下序列依次串联组成:序列表序列I的第12923位至第13538位序列，序列表序列I的第I位至第6位序列和所述DNA片段b的 核苷酸序列。本专利技术保护含有所述DNA片段的重组载体、重组菌、重组细胞或重组病毒。所述含有所述DNA片段的重组载体可为在载体pTRE2的所述人类巨噬细胞的立早启动子基因下游依次插入所述丙型肝炎病毒全基因组基因和所述丁型肝炎病毒核酶基因获得的重组载体，所述重组载体具体可为序列表中序列I所示的重组载体。本专利技术保护上述任一所述DNA片段、重组载体、重组菌、重组细胞或重组病毒在构建受四环素或四环素衍生物诱导的丙型肝炎病毒全基因组表达的转基因动物模型的应用，或在制备构建受四环素或四环素衍生物诱导丙型肝炎病毒全基因组表达的转基因动物模型的产品中的应用。在上述应用中,所述动物为小鼠。在上述应用中，所述构建受四环素或四环素衍生物诱导丙型肝炎病毒全基因组表达的转基因动物模型包括如下步骤:I)将所述DNA片段显微注射所述小鼠受精卵细胞的原核DNA，获得基因组中整合丙型肝炎病毒全基因组的转基因小鼠A ；2)将步骤I)获得的所述转基因小鼠A与表达rtTA的转基因小鼠B杂交，获得基因组中整合丙型肝炎病毒全基因组和所述rtTA基因的转基因小鼠C，所述转基因小鼠C即所述受四环素或四环素衍生物诱导丙型肝炎病毒全基因组表达的转基因动物模型。在上述应用中，所述丙型肝炎病毒全基因组表达为肝组织特异性表达。在上述应用中，所述四环素衍生物具体可为强力霉素。在本专利技术的实施例中，所述表达rtTA的转基因小鼠B为小鼠白蛋白启动子调控的肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠“albumin-rtTA transgenic”。实验证明，将本专利技术的DNA片段导入小鼠基因组后，与由小鼠白蛋白启动子调控表达rtTA的转基因小鼠杂交，获得整合HCV全长基因和rtTA基因的双转基因小鼠，在强力霉素(Dox)诱导的情况下，该双转基因小鼠可肝组织特异性表达HCV全长基因，并在小鼠血清中可检测到HCV病毒RNA，经ant1-miR122分子药物治疗后，HCV的复制受到明显的抑制，而对照组在DOX的诱导下，HCV表达整体呈明显升高的趋势，证实Tet-on-HCV双转基因小鼠作为DOX诱导HCV全基因组表达的转基因动物模型，可成功用于HCV药物筛选和评价。由于该动物模型免疫正常，因而能针对HCV的表达产生特异性的抗病毒免疫反应，从而可有效应用于HCV疫苗药物评价、病毒感染的免疫病理损伤机制研究。附图说明图1为重组载体pTRE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种DNA片段，其核苷酸序列由如下序列依次串联组成：细菌四环素耐药操纵子的操纵基因序列、人类巨噬细胞的立早启动子基因序列、丙型肝炎病毒全基因组基因序列和具有在DNA和/或RNA水平上剪切丙型肝炎病毒全基因组活性的核酶的基因序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周育森，孙世惠，周小军，刘晨风，赵光宇，曾扬，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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