本发明专利技术公开了一种基于受体传感器检测苦味物质地那的方法，首先在HEK-293细胞表面表达了带有His6-tag标签的苦味受体蛋白T2R4，并提取苦味受体蛋白T2R4将其利用适配体有效地固定在石英晶体微天平表面构建成受体传感器；通过测试一系列含已知确定浓度苦味物质地那的溶液，得到地那浓度-谐振频率改变量标准曲线；然后测试含有未知浓度苦味物质地那的待测溶液，根据石英晶体微天平谐振频率的改变量和地那浓度-谐振频率改变量标准曲线得到待测溶液中苦味物质地那的浓度。本发明专利技术方法所需仪器简单、操作方便，解决了敏感元件苦味受体蛋白T2R4与石英晶体微天平的稳定耦合，实现了液相环境中苦味物质地那的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测技术，尤其涉及一种基于受体传感器用于液相环境中检测苦味物质地那的方法。
技术介绍
苦味物质检测在食品科学、生物医学、环境保护等领域具有重要的应用，具有十分广阔的应用前景和市场开发价值。苦味化合物的种类多样、结构各异，给检测带来诸多困难。传统的检测方法是基于质谱分析技术，所需仪器昂贵、操作复杂、分析检测周期长，难以满足当今对苦味物质现场、快速检测的需求。新兴的生物传感器为解决这一难题提供了新的技术途径。但是目前用于苦味物质检测的生物传感器多是利用类脂膜、溴化物等材料作为敏感元件，存在特异性差、灵敏度低和不稳定的缺点，其应用难以满足特异性苦味物质检测的要求。因此，如何获得高度特异的敏感元件，并实现敏感元件与二级传感器的稳定耦合是目前苦味物质检测传感器进一步发展亟需解决的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的:，该方法包括以下步骤: (1)制备苦味受体蛋白T2R4; (2)将苦味受体蛋白T2R4固定在石英晶体微天平传感器表面制成受体传感器； (3)将不含任何苦味物质的水溶液泵入密闭的检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将含有某一确定浓度的苦味物质地那的溶液泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为此确定浓度的传感器响应值，最后再泵入不含任何苦味物质的水溶液，清洗检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔IOmin后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后，再泵入含有另一确定浓度的苦味物质地那的溶液进行下一次检测；重复上述步骤，可以得到一系列苦味物质地那的浓度对应的传感器谐振频率改变量，得到地那浓度-谐振频率改变量曲线； (4)对于未知浓度的苦味物质地那，首先将不含任何苦味物质的水溶液泵入密闭的检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态Ftl后，再将含有未知浓度的苦味物质地那的待测溶液泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1- F0,最后根据上述步骤3得到的地那浓度-谐振频率改变量曲线得到待测溶液中苦味物质地那的浓度，实现液相中苦味物质地那的浓度检测。进一步地，所述步骤(I)包括以下子步骤: (1.0构建表达载体:含有人苦味受体基因T2R4和rho-tag信号肽序列全长cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，构建苦味受体基因22的表达载体过程如下:首先，设计相应的引物，获取和扩增苦味受体基因序列全长cDNA，并对苦味受体基因进行适当的修饰，上游引物序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶链式反应使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反应体系中进行，温度循环首先是94°C预变性30秒，接着进行29个循环的95°C变性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最后是20 0C降温20秒；扩增后的产物通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体的多克隆位点治μ /和Afoi /之间，完成苦味受体的表达载体的构建，并通过测序对基因序列进行鉴定得表达载体的基因序列如SEQ IDN0.4所示； (1.2)人胚胎肾细胞HEK-293的培养和转染:HEK_293细胞培养液为添加了体积百分比为10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培养条件为37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱；转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种0.5 2X IO5 cells/mL浓度的细胞500 μ L，在不含抗生素的培养液里生长至转染前90-95%的融合度；转染试剂为Iipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体pCEP4/rho-T2R4-hise转染HEK-293细胞；每孔使用4 μ g表达质粒，首先把表达质粒用无血清培养液稀释到50 μ L，混匀；再用无血清细胞培养液稀释10 UL的脂质体转染试剂Iipfectamin 2000至50 yL,在室温下孵育5 min ;接着把稀释的表达质粒和Iipfectamin2000混合,摇匀，室温孵育20 min ;把100 μ L的混合液加到六孔板中每一个含有细胞和培养液的孔中，前后摇板混匀后，在37°C、体积百分比为5% CO2的培养箱孵育24 h;含有特异性抗融合表达的His6-tag的苦味受体蛋白T2R4即可在细胞膜表面表达； (1.3)苦味受体蛋白T2R4的提取:转染后的HEK-293细胞用PBS清洗，并从六孔板收集；收集的细胞用超声波探头超声5 min，然后16000 g离心40 min ;浮在表面的是细胞溶质部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素标本缓冲液混合；小球用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的细胞裂解液在0°C冰冻条件下溶解30 min ;然后，将尿素样品缓冲液加入到溶解的小球溶液中，即可获得粗提的膜蛋白，其中含有异源表达于细胞膜上的苦味受体蛋白T2R4 ;含有苦味受体蛋白T2R4的细胞膜组分用于构建石英晶体微天平传感器，细胞膜的疏水环境有利于保持苦味受体的结构和功能。所述步骤(2)具体为:本专利技术的苦味受体传感器制备过程如下；在干净的石英晶体微天平传感器的金电极表面通过金硫键共价固定一层可以特异性识别融合表达的Hi s6-tag标签的自组装巯基化单链DNA适配体，该适配体由5’末端共价修饰了 HS-(CH2)6基团的SEQ ID N0.5所示的基因序列组成,反应条件为室温下反应I小时；用质量百分比为1%的牛血清白蛋白封闭石英晶体微天平传感器的金电极表面未反应的位点，封闭条件为室温下I小时；把含有异源表达的苦味受体蛋白T2R4的细胞膜均匀涂覆在石英晶体微天平传感器的金电极表面，并放在室温孵育过夜，使苦味受体蛋白通过融合表达的His6_tag与适配体发生特异性的结合，实现在石英晶体微天平传感器的金电极表面特异性固定和纯化苦味受体蛋白T2R4的目的；石英晶体微天平传感器的金电极表面用PBS冲洗，除去未结合的多余物质；完成石英晶体微天平传感器的构建。本专利技术的有益效果，本专利技术采用苦味受体蛋白作为传感器的敏感元件，克服了传统的苦味物质检测传感器中所采用的类脂膜、溴化物等材料存在的特异差、灵敏度低的缺点，可以实现液相环境中特异性苦味物质地那的检测。该传感器采用自组装适配体固定苦味受体蛋白，不仅可以形成高度稳定的自组装敏感膜，提高传感器的稳定性，而且由于适配体和苦味受体蛋白间特异性的相互作用，可以实现膜受体的片上纯化，细胞膜上其它蛋白由于缺乏与适配体的亲和力，在制备传感器的过程中会被冲洗去除，进而有利于提高受体蛋白在传感器表面的固定效率和分布密度，最终有助于提高传感器的灵敏度、特异性和稳定性。该检测方法检测腔小，可以大大节约检测试剂，显著减少样品的消耗量。此外，该传感器采用石英晶体微天平作为二级传感器，可以实现对苦味物质的实时、快速检测，克服了基于质谱的检测方法存在的检测周期长、检测流程复杂、无法实现现场检测的缺点，适合应用于进一步开发便携式苦味物质检测传感器。以上这些优点和功能可以满足液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于受体传感器检测苦味物质地那的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）制备苦味受体蛋白T2R4；（2）将苦味受体蛋白T2R4固定在石英晶体微天平传感器表面制成受体传感器；（3）将不含任何苦味物质的水溶液泵入密闭的检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将含有某一确定浓度的苦味物质地那的溶液泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为此确定浓度的传感器响应值，最后再泵入不含任何苦味物质的水溶液，清洗检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔10min后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后，再泵入含有另一确定浓度的苦味物质地那的溶液进行下一次检测；重复上述步骤，可以得到一系列苦味物质地那的浓度对应的传感器谐振频率改变量，得到地那浓度?谐振频率改变量曲线；（4）对于未知浓度的苦味物质地那，首先将不含任何苦味物质的水溶液泵入密闭的检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态F0后，再将含有未知浓度的苦味物质地那的待测溶液泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1??F0，最后根据上述步骤3得到的地那浓度?谐振频率改变量曲线得到待测溶液中苦味物质地那的浓度，实现液相中苦味物质地那的浓度检测。...
【技术特征摘要】
1.一种基于受体传感器检测苦味物质地那的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)制备苦味受体蛋白T2R4； (2)将苦味受体蛋白T2R4固定在石英晶体微天平传感器表面制成受体传感器； (3)将不含任何苦味物质的水溶液泵入密闭的检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将含有某一确定浓度的苦味物质地那的溶液泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为此确定浓度的传感器响应值，最后再泵入不含任何苦味物质的水溶液，清洗检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔IOmin后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后，再泵入含有另一确定浓度的苦味物质地那的溶液进行下一次检测；重复上述步骤，可以得到一系列苦味物质地那的浓度对应的传感器谐振频率改变量，得到地那浓度-谐振频率改变量曲线； (4)对于未知浓度的苦味物质地那，首先将不含任何苦味物质的水溶液泵入密闭的检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态Ftl后，再将含有未知浓度的苦味物质地那的待测溶液泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定到F1后，得到谐振频率改变量F1- F0,最后根据上述步骤3得到的地那浓度-谐振频率改变量曲线得到待测溶液中苦味物质地那的浓度，实现液相中苦味物质地那的浓度检测。2.根据权利要求1所述苦味物质地那的检测方法，其特征在于，所述步骤I包括以下子步骤: (1.0构建表达载体:含有人苦味受体基因T2R4和rho-tag信号肽序列全长cDNA的jmLpCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ ID N0.1，构建苦味受体基因22的表达载体过程如下:首先，设计相应的引 物，获取和扩增苦味受体基因序列全长cDNA，并对苦味受体基因进行适当的修饰，上游引物序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物序列如SEQ ID N0.3所示，聚合酶链式反应使用高保真聚合酶STAR在50 μ L反应体系中进行，温度循环首先是94°C预变性30秒，接着进行29个循环的95°C变性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸60秒，最后是.20 0C降温20秒；扩增后的产物通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体的多克隆位点治μ /和Afoi /之间，完成苦味受体的表达载体的构建，并通过测序对基因序列进行鉴定得表达载体的基因序列如SEQ IDN0.4所示； (1.2)人胚胎肾细胞HEK-293的培养和转染:HEK_293细胞培养液为添加了体积百分比为10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μ g/mL)的DMEM，培养条件为37°C、体积百分比为5% CO2...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴春生，邹玲，杜立萍，王平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。