生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束，提高有治疗作用的生物功能性蛋白大分子生物利用度，延长其半衰期；同时提供一种胶束的制备方法。本发明专利技术将生物功能性蛋白大分子（促红细胞生成素，干扰素，抗体等）成功包入嵌段聚合物胶束，粒径小于100nm,?Zeta电位接近0mv,?包封率显著提高。生物功能性蛋白大分子胶束大大提高了蛋白的稳定性，胶束溶液制成注射制剂或注射用冻干制剂用于临床，实现药物的长效缓释，提高生物利用度。

【技术实现步骤摘要】
生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束及其制备和应用
本专利技术涉及含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束及其制备方法以及该胶束在药物制剂中的应用。
技术介绍
蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类，一般通过静脉和皮下注射给药。经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解，导致活性降低，生物利用度低，要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药，不仅给患者带来不便，且易产生耐受性，耐药性及免疫原性等不良反应，因此临床上需要研制长效的蛋白药物制剂。目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；2、用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特性，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型物的平衡向游离型药物方向移动；3、减少异源蛋白免疫原性，从而减少其体内清除率。方法主要有：构建突变体，PEG化修饰，血清白蛋白融合，但制备过程比较复杂，成本较高。近几年，聚合物胶束以其制备简单，增加溶解及靶向作用等优点被越来越多的研发机构所关注。胶束粒径一般小于100nm,可以避免体内网状内皮组织(RES)的非选择性截留，从而实现药物的靶向供给,而且避免快速的肾脏消除。带正电的胶束很容易和血液中白蛋白发生吸附作用，带负电的有被血小板表面附着的倾向，而且电势绝对值越大，越容易吸附。胶束接近中性的表面可以减少胶束和这些成分吸附，提高在血液中稳定性。聚合物胶束由疏水内核和亲水外壁组成，具有很多优点，如制备方法简单，增加溶解及靶向作用等。PEG，PEO是常用的亲水外壁，在胶束内核和水相外界中提供一个稳定的界面；PLA生物可降解性和生物相容性良好；目前PEG-PLA，PEG-PCL，PEO-PLA等嵌段聚合物胶束主要用于解决疏水性药物的溶解性，其中Sanyang公司GenexolPM在韩国已经上市，多柔比星与PEG-P(Asp)形成的聚合物胶束NK911在日本已经进入PhaseII。但用于蛋白药物包封的报道特别是用于生物功能性蛋白大分子，目前还没有。
技术实现思路
本申请人经过深入研究，提供了一种含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束，所述聚合物胶束是指合成的两亲性嵌段共聚物在水相中自主装形成的一种热力学稳定的胶体溶液；所述有治疗作用的生物功能性蛋白大分子是指执行一些在体内的生物学功能，且分子量大于15K道尔顿的具有生物活性的蛋白质。胶束提高有治疗作用的生物功能性蛋白大分子生物利用度，延长其半衰期。同时提供一种胶束的制备方法，包括将两亲性聚合物与有治疗作用的生物功能性蛋白大分子溶液注入到pH值为有治疗作用的生物功能性蛋白大分子等电点±2.0的缓冲溶剂，成功的将有治疗作用的生物功能性蛋白大分子（促红细胞生成素，干扰素，抗体等）包入嵌段聚合物形成胶束。胶束含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子和两亲嵌段共聚物，所述两亲嵌段共聚物为两亲性的人工合成聚合物及其衍生物，优选在生物功能性蛋白大分子中加入赖氨酸，更优选加入赖氨酸的量与生物功能性蛋白大分子的质量比至少大于1:1。所述两亲嵌段共聚物亲水嵌段为聚乙二醇类、聚丙烯酸类、聚氧乙烯类、聚乙烯醇类，疏水嵌段为内酯类共聚物或均聚物；优选亲水嵌段是聚乙二醇，疏水嵌段是聚乳酸(PLA)或乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)；所述两亲嵌段共聚物，亲水嵌段具有500-30,000的重均分子量，疏水嵌段具有500-50,000的重均分子量；优选亲水嵌段重均分子量是4000-20,000，疏水嵌段重均分子量是5000-20,000。所述治疗作用的生物功能的蛋白大分子为促红细胞生成素（EPO），干扰素，粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）,曲妥珠单抗。生物功能的蛋白大分子的等电点为促红细胞生成素（EPO）3.7-4.1；干扰素5.7-6.2；细胞集落刺激因子5.8-6.6；曲妥珠单抗8.5-9.2。胶束中有治疗作用的生物功能性蛋白大分子与两亲嵌段共聚物的质量比为1:50~500，优选质量比为1:50~200。胶束的制备方法，包括下列步骤：将两亲嵌段聚合物在有机溶剂中溶解或分散，将有治疗作用的生物功能性蛋白大分子用溶液溶解后，优选在生物功能性蛋白大分子溶液中加入赖氨酸，更优选加入赖氨酸的量与生物功能性蛋白大分子的质量比至少大于1:1，将两种溶液注入到pH值为有治疗作用的生物功能性蛋白大分子等电点±2.0的缓冲溶剂中，搅拌挥发除去有机溶剂，除去游离药物，制得粒径为10-1000nm的胶束溶液；所述有机溶剂为乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮等有机溶剂，或其混合溶剂；优选丙酮。所述缓冲溶液pH值优选为有治疗作用的生物功能性蛋白大分子等电点±1.0，最优为等电点；缓冲溶液为制剂研究及生产常用试剂，例如PBS，HEPES,柠檬酸盐缓冲液等。所述制备方法得到的有治疗作用的生物功能性蛋白大分子聚合物胶束制成注射液制剂或注射用冻干制剂，将胶束溶液按注射液制剂常用工艺，直接分装于安瓿或西林瓶中制得；或将胶束溶液冻干成固体粉末，按冻干制剂制备常用工艺，制成注射用冻干制剂。实施例中采用的原料和检测方法如下：有治疗作用的生物功能性蛋白大分子聚合物胶束的两亲嵌段共聚物制备，参考论文（硕士论文，PLA-PEG嵌段共聚物的合成及在组织工程药物释放中的应用，天津大学，2006；PEG-PCL,共聚物纳米粒降解行为及其用作药物载体的研究，上海交通大学，2008）制备PEG-PLA，PEG-PCL，PEO-PLA嵌段共聚物的方法，在辛酸亚锡催化下，PEG或PEO作为大分子引发剂，在无水无氧，120度下加热20h，引发丙交酯或己内酯聚合，最终形成PEG-PLA，PEG-PCL，PEO-PLA。聚合物胶束的形貌的观察：用透射电镜（JEOL100CX-II透射电子显微镜，日本电子光学公司）对胶束的形态进行观察，加速电压为80KV．将胶束的水溶液(1.0mg／m1)滴到表面附有Formar支撑膜的铜网上并用l％的磷钨酸染色，用滤纸吸去多余的水，在空气中将样品晾干后进行TEM观察。聚合物载药胶束的平均粒径和Zeta电位：将3ml聚合物载药胶束水溶液加入到比色皿中，采用动态光散射仪(NicompTM380/ZLSPSS,USA)，激光源为He-Ne，波长633nm，光散射角为90°，测试温度为25℃。测量其粒径和粒径分布。附图说明图1胶束电镜图图2体外释放考察图图3大鼠体内血药浓度时间图图4胶束组和EPO组的血红蛋白浓度值与时间比图图5胶束组和EPO组的网织红百分比提高值与时间比图图6胶束在不同氯化钠浓度中稳定性图7胶束在不同pHPBS中稳定性具体实施方式下面通过实施例对本专利技术加以进一步的说明，但不以任何形式限制本专利技术。实施例1PEG-PLA(55)在pH7.4PBS中制备EPO胶束室温条件下（最佳低于25℃），20mgPEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μl（0.2mg）EPO原液（50000IU/mlEPO，深圳新鹏生物工程有限公司，C20110501S），同时注入搅拌的PBS（10mM，pH7.4）中,转速1800rpm,(智能多点磁力搅拌器，ZNCL-DS，河南爱博特科技发展有限公司)搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01NNaOH将制得的溶液pH调为7.0即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶束，其特征在于，含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子和两亲嵌段共聚物，所述两亲嵌段共聚物为两亲性的人工合成聚合物及其衍生物。

【技术特征摘要】
2011.11.17 CN 201110364172.31.一种胶束，其特征在于含有有治疗作用的生物功能性蛋白大分子和两亲嵌段共聚物，所述有治疗作用的生物功能性蛋白大分子是指执行一些在体内的生物学功能，且分子量大于15K道尔顿的具有生物活性的蛋白质，所述两亲嵌段共聚物为两亲性的人工合成聚合物及其衍生物，共聚物的亲水嵌段为聚乙二醇类、聚丙烯酸类、聚氧乙烯类、聚乙烯醇类，疏水嵌段为内酯类共聚物或均聚物，共聚物亲水嵌段具有500-30,000的重均分子量，疏水嵌段具有500-50,000的重均分子量，所述胶束中含有赖氨酸，赖氨酸与有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的质量比大于1:1。2.根据权利要求1所述的胶束，其特征在于所述亲水嵌段是聚乙二醇，疏水嵌段是聚乳酸或乳酸和乙醇酸的共聚物。3.根据权利要求1所述的胶束，其特征在于所述亲...

【专利技术属性】
技术研发人员：史亚楠，李又欣，孙考祥，刘万卉，王涛，鲁越，
申请(专利权)人：山东绿叶制药有限公司，南京绿叶思科药业有限公司，
类型：发明
国别省市：