本发明专利技术公开了一种免疫基底的制备方法及抗原或抗体的免疫检测方法，该免疫基底制备方法利用金或银纳米粒子修饰硅片，再在金或银纳米粒子表面修饰抗体/抗原，用于捕获待测抗原/抗体；该抗原或抗体的免疫检测方法应用上述免疫基底的制备方法制备得到的免疫基底以及金或银纳米粒子免疫探针，通过抗原-抗体的免疫复合反应，形成免疫基底-抗原/抗体-免疫探针三层夹心结构，利用金或银纳米粒子的表面增强拉曼散射效应，检测免疫探针表面拉曼标记物的特征指纹谱实现待测抗原/抗体检测，该方法能够大大提高免疫检测的灵敏度，而且可进行高通量的多抗原或多抗体检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种拉曼光谱检测技术，尤其是涉及。
技术介绍
拉曼散射是光子的非弹性散射，由分子振动或转动能级跃迁产生。利用拉曼散射光谱技术可以在分子水平分析生物组织、细胞的物质组成及含量变化。由于拉曼散射光谱技术具有快速、无损、灵敏度高等特点，因此被广泛地应用于生命科学、生化材料以及药物的检测和分析。然而，通常情况下拉曼信号较弱，不能满足高灵敏度检测分析的要求。1974年，Fleischmann等人首次从电化学池中银电极表面单分子层批唳吸附物的拉曼散射实验中发现了表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman scattering, SERS)现象，为拉曼散射光谱技术的应用开辟了新的途径，特别适用于吸附在贵金属纳米粒子表面化合物分子的检测和分析。另一方面，金属(金或银)纳米粒子除了具有小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应等特性，还具有良好的生物相溶性，适合作为载体使生物分子(如抗原或抗体)和荧光染料分子作为拉曼标记物吸附在金属(金或银)纳米粒子表面制备成免疫探针，使得拉曼标记物的拉曼信号能够被放大IO12 IO15倍，弥补了通常情况下拉曼信号较弱的缺点，满足了生物医学上免疫检测和分析的高灵敏度要求。目前，抗原与抗体的检测方法主要有:放射免疫检测法、酶联免疫检测法、荧光免疫检测法和表面增强拉曼散射(SERS)免疫检测法等，这些方法各有特点，例如:放射免疫分析法和荧光免疫分析法的检测灵敏度较高，但放射性物质的放射辐射和污染、传统荧光团的发射谱线较宽(半峰全宽(FWHM)约为50 IOOnm)以及易于光降解等问题限制了放射免疫分析法与荧光免疫法的应用；酶联免疫分析法具有高通量检测的功能，但不适用于超灵敏检测；表面增强拉曼散射(SERS)免疫检测法，灵敏度高，光谱谱线窄，适用于高通量无损检测分析，但是利用SERS效应进行免疫检测，需要良好的SERS基底。尽管通过光刻、电子束刻蚀、反应离子刻蚀、纳米压印等微纳加工技术可以制备出精度高、形貌复杂的SERS基底，但是所采用的微纳加工设备构造复杂、费用昂贵，且制作过程耗时长、成本高、制备得到的基底面积小并不易大规模量产。而利用化学方法合成金属(金和银)纳米粒子作为SERS基底，相对容易，但是金属纳米粒子处于溶液相，在检测过程中，纳米粒子很容易随机聚集，且很难控制，得到的SERS信号的稳定性和可重复性较差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种工艺过程简单、成本低且耗时少的免疫基底的制备方法。本专利技术所要解决的另一个技术问题是利用第一个技术问题中的免疫基底的制备方法制备得到的免疫基底实现抗原或抗体免疫检测的方法，该方法能够有效地提高抗原或抗体检测分析的灵敏度和稳定性，能够实现高通量多抗原或多抗体检测。本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为:一种免疫基底的制备方法，其特征在于包括以下步骤: ①-1、将单面抛光的硅片浸入有机溶剂中，并对硅片进行超声波清洗20 40分钟，然后用去离子水冲洗超声波清洗后的硅片，再对冲洗干净的硅片进行干燥处理； ①_2、在冰浴条件下，按体积比为1:3的比例，将质量百分比为20% 40%的过氧化氢溶液缓慢加入到质量百分比为80% 98%的浓硫酸溶液中，制备得到氧化剂溶液； ①-3、将经步骤①-1清洗并干燥过的硅片浸入由步骤①-2制备得到的氧化剂溶液中，在氧化剂溶液中反应0.5 I小时以去除硅片上的有机物，之后取出硅片，用去离子水冲洗硅片数次，然后对硅片进行干燥处理； ①_4、将经步骤①-3处理后的硅片浸入质量百分比为5% 20%的氢氟酸溶液中，在氢氟酸溶液中反应0.5 I小时后，立即取出硅片并浸入质量百分比为1% 3%的硝酸银溶液或质量百分比为0.05% 2%的氯金酸溶液中，缓慢搅拌I 3分钟，即得到银纳米粒子或金纳米粒子修饰的硅片，取出硅片进行干燥处理； ①_5、将用于进行抗原检测的抗体溶液或用于进行抗体检测的抗原溶液滴加到经步骤①_4处理后得到的银纳米粒子或金纳米粒子修饰的硅片的抛光面上，并在温度为2 8°C、湿度为40 80%的条件下静置10 12小时，之后依次用三羟甲基氨基甲烷缓冲液和去离子水冲洗硅片，以去除未吸附到银纳米粒子或金纳米粒子上的抗体或抗原，最后对吸附有抗体或抗原的银纳米粒子或金纳米粒子修饰的硅片进行干燥处理； ①_6、在经步骤①-5处理后的硅片的抛光面上，滴加与步骤①_5中滴加的抗体溶液或抗原溶液相同体积的牛血清白蛋白溶液，在室温下反应2 4小时，之后依次用含有0.05%Tween 20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲液和去离子水对硅片进行冲洗，以去除未吸附到银纳米粒子或金纳米粒子上的牛血清白蛋白，再对硅片进行干燥处理，制备得到具有特异性选择功能的免疫基底。所述的步骤①-1中的有机溶剂为丙酮或酒精或甲苯。所述的步骤①_5中所滴加的抗体溶液为一种抗体的溶液或为多种抗体的混合溶液，所滴加的抗体溶液的浓度为I 3mg/ml ;或所滴加的抗原溶液为一种抗原的溶液或为多种抗原的混合溶液，所滴加的抗原溶液的浓度为I 3mg/ml。所述的步骤①_5中所滴加的抗体溶液的种类由待检测的抗原决定；或所滴加的抗原溶液的种类由待检测的抗体决定。所述的步骤①-5中所滴加的抗体溶液的体积由所选用的硅片的抛光面的大小决定；或所滴加的抗原溶液的体积由所选用的硅片的抛光面的大小决定。所述的步骤①-6中所滴加的牛血清白蛋白溶液的质量百分比为2 4%。本专利技术解决上述另一个技术问题所采用的技术方案为:一种利用上述的免疫基底的制备方法制备得到的免疫基底实现抗原或抗体的免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤: ②-1、制备免疫探针溶液，其中免疫探针溶液中的免疫探针的表面吸附的抗体或抗原的种类与上述第一个技术问题中所述的免疫基底的制备方法制备得到的免疫基底上所吸附的抗体或抗原的种类相同； ②-2、将待测抗原溶液或待测抗体溶液滴加到利用上述第一个技术问题中所述的免疫基底的制备方法制备得到的免疫基底的吸附有抗体或抗原的表面上，在温度为30 38°C的条件下反应2小时；之后依次用含有0.05% Tween 20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和去离子水对免疫基底进行冲洗，以去除未与免疫基底上的抗体或抗原发生免疫复合反应的抗原或抗体，再对免疫基底进行干燥处理； ②_3、在经步骤②-2处理后得到的免疫基底的吸附有待测抗原或待测抗体的表面上，滴加与步骤②_2中所滴加的待测抗原溶液或待测抗体溶液相同体积的免疫探针溶液，在温度为4°C的恒温条件下反应1.5 3小时；之后依次用含有0.05% Tween 20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和去离子水对免疫基底进行冲洗，以去除未与免疫基底上所固定的待测抗原或待测抗体发生免疫复合反应的免疫探针，再对免疫基底进行干燥处理； ②_4、利用拉曼光谱仪对经步骤②-3处理后得到的免疫基底进行光谱测量，如果步骤②-2中所滴加的待测抗原溶液中的抗原与上述第一个技术问题中所述的免疫基底的制备方法制备得到的免疫基底上的抗体以及免疫探针中的抗体发生免疫复合反应，则能够检测到免疫探针中的拉曼标记物的特征指纹谱；或如果步骤②_2中所滴加的待测抗体溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种免疫基底的制备方法，其特征在于包括以下步骤：①?1、将单面抛光的硅片浸入有机溶剂中，并对硅片进行超声波清洗20～40分钟，然后用去离子水冲洗超声波清洗后的硅片，再对冲洗干净的硅片进行干燥处理；①?2、在冰浴条件下，按体积比为1:3的比例，将质量百分比为20%～40%的过氧化氢溶液缓慢加入到质量百分比为80%～98%的浓硫酸溶液中，制备得到氧化剂溶液；①?3、将经步骤①?1清洗并干燥过的硅片浸入由步骤①?2制备得到的氧化剂溶液中，在氧化剂溶液中反应0.5～1小时以去除硅片上的有机物，之后取出硅片，用去离子水冲洗硅片数次，然后对硅片进行干燥处理；①?4、将经步骤①?3处理后的硅片浸入质量百分比为5%～20%的氢氟酸溶液中，在氢氟酸溶液中反应0.5～1小时后，立即取出硅片并浸入质量百分比为1%～3%的硝酸银溶液或质量百分比为0.05%～2%的氯金酸溶液中，缓慢搅拌1～3分钟，即得到银纳米粒子或金纳米粒子修饰的硅片，取出硅片进行干燥处理；①?5、将用于进行抗原检测的抗体溶液或用于进行抗体检测的抗原溶液滴加到经步骤①?4处理后得到的银纳米粒子或金纳米粒子修饰的硅片的抛光面上，并在温度为2～8℃、湿度为40～80%的条件下静置10～12小时，之后依次用三羟甲基氨基甲烷缓冲液和去离子水冲洗硅片，以去除未吸附到银纳米粒子或金纳米粒子上的抗体或抗原，最后对吸附有抗体或抗原的银纳米粒子或金纳米粒子修饰的硅片进行干燥处理；①?6、在经步骤①?5处理后的硅片的抛光面上，滴加与步骤①?5中滴加的抗体溶液或抗原溶液相同体积的牛血清白蛋白溶液，在室温下反应2～4小时，之后依次用含有0.05%?Tween?20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和去离子水对硅片进行冲洗，以去除未吸附到银纳米粒子或金纳米粒子上的牛血清白蛋白，再对硅片进行干燥处理，制备得到具有特异性选择功能的免疫基底。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周骏，束磊，马亚楠，王彬彬，赖魏，张琪，颜承恩，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：
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