本发明专利技术涉及一种从常用中药材板蓝根中高效提取、分离和纯化抗病毒活性成分表告伊春的方法，目的在于提供一种简便、安全、经济、高效地从板蓝根中提取、分离和纯化高纯度活性单体化合物表告伊春的技术。本发明专利技术采用的技术方案是：以干燥的板蓝根为原料，采用匀浆破碎酶解技术、酶辅助负压空化提取技术，絮凝除杂技术，大孔吸附树脂富集分离技术，溶剂抽提纯化技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效提取、分离和纯化技术手段得到纯度达98%以上的表告伊春。本发明专利技术所得目标化合物纯度高，生产制备量大，适用于工业化应用，对从中药板蓝根中获取抗病毒活性单体成分表告伊春提供了一种高效的现代化技术手段，具有良好的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从药用植物中高效提取、分离和纯化功能性成分的ー种方法，具体是从传统中药材板蓝根中高效提取、分离和纯化抗病毒活性成分表告伊春的方法，属于天然产物提取、分离和纯化领域。
技术介绍
板蓝根是ー种常用的传统中药材，首载于我国第一部本草著作《神农本草经》，《中华人民共和国药典》(2010版)明确规定为十字花科植物蒋蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，主产于我国河北、安徽、江苏、河南、黑龙江等省，具有清热解读，凉血利咽之功效，用于温毒发斑，舌绛紫暗，痄腮，喉痹，烂喉丹痧，大头瘟疫，丹毒，痈肿等。现代药理研究证实，板蓝根具有抗病毒、抗内毒素、免疫调节、抗肿瘤、抗菌、抗炎、活血化瘀等众多活性。其中，板蓝根的抗病毒活性非常显著，板蓝根生药及其相关制剂对于流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒、こ型脑炎病毒、こ型肝炎病毒、肾综合征出血热病毒、柯萨奇B4病毒、伪狂犬病病毒等各种病毒具有不同程度的抑制作用。板蓝根作为广泛应用于临床的抗病毒天然植物药材，对其抗病毒活性成分的提取、分离和纯化具有十分重要的市场价值。国内外相关文献报道生物碱为板蓝根的主要活性成分，表告伊春(Epigoitrin)作为其中ー种主要的含硫生物碱，具有显著的抗病毒活性，是目前评价板蓝根生药及其相关制剂质量的重要指标成分(徐丽华等，中国天然药物，2005，3 (6):359-360; Huang，Q.S., et al., Plant Medica, 1981, 42 (3): 308-310)。目前从板蓝根中提取表告伊春主要采用传统的技术手段，如煎煮法、浸溃法、渗漉法、热回流法等，这些方法都是在完整细胞的情况下，通过浸润与滲透，使提取溶剂进入组织细胞，溶解胞内活性物质并使其扩散至提取溶剂之中。由于细胞壁的屏障作用，使得中药材有效成分的提取效率有一定的限度。同时这些提取方法存在提取温度过高，耗时长、能源利用率低、提取出的杂质多、后续处理繁琐等缺点。中国专利申请号200410016902.0和200710011038.9分别公开了一种表告伊春纯品的制备方法，是以中药材板蓝根为原料，通过提取、富集、分离和纯化等步骤得到表告伊春。前者采用95%こ醇回流提取，成本过高，提取率极低，同时以高毒性的氯仿和甲醇作为洗脱液通过中性氧化铝柱层析得到目标物，安全隐患大。后者利用水煎煮提取，操作温度高，对目标成分破坏大，提取率低下，且以价格高昂的色谱甲醇为洗脱液采用高效液相制备手段纯化表告伊春，成本过高，制备量小，无法实现エ业化大規模生产。综上所述，传统的提取、分离和纯化表告伊春的技术エ艺不能达到高效利用板蓝根资源和获得高得率、高纯度的表告伊春的目的。因此有必要寻求ー种简便、安全、经济、高效的提取、分离和纯化表告伊春的方法，促进对板蓝根资源的深度开发和利用，为抗病毒新药开发提供积极有利条件。本专利技术g在建立ー种通过现代生物诱导的提取技术和分离纯化技术相结合的方法，实现从板蓝根 中高效提取、分离和纯化高纯度表告伊春的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种以中药板蓝根为原料，通过匀浆破碎酶解技术，酶辅助负压空化提取技木，絮凝除杂技木，大孔吸附树脂富集分离技木，溶剂抽提纯化技木，正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效提取、分离和纯化技术实现简单、快速、大量的获得高纯度表告伊春単体成分。本专利技术所采用的技术方案:将中药板蓝根和配制好的酶溶液混合，转移入匀浆-负压空化提取器中，进行匀浆破碎酶解和酶辅助负压空化提取，经过匀浆破碎、外源酶水解细胞壁、内源酶生物转化以及负压空化的高效提取，增强了表告伊春在粗提物中的含量，然后经过絮凝除杂、大孔吸附树脂富集分离、溶剂抽提纯化、正相硅胶中压柱层析后得到表告伊春产品，经过低温析晶和重结晶后得到纯度大于98%的精制产品。具体方案如下:(I)匀浆破碎酶解:配制浓度为25(T500U/mL的酶溶液，加入柠檬酸缓冲溶液调节pH值至4.(T5.0，将酶溶液和板蓝根药材以溶液体积与原料质量比为3(T50mL/g混合，连续勻衆I 3次,姆次I 3min。(2)酶辅助负压空化提取:将含有酶的匀浆液自动导入负压空化提取装置中，在温度为35 45° C，压カ为0.07 0.09Mpa下，连续负压空化提取，每次6(T90min，提取I 3次。(3)絮凝除杂:在提取液中加入95%的こ醇，充分搅拌至溶液醇浓度达65%左右，(T4° C冷藏12 24h，过滤，滤渣弃去，浓缩滤液至干回收こ醇并得到固形物。絮凝除杂可以使ー些大分子水溶性杂质如多糖，蛋白质，粘液质和鞣质等形成沉淀而被去除，使目标化合物的含量得到初步富集。(4)大孔吸附树脂富集分离:将絮凝除杂后所得的固形物用蒸馏水溶解后，通过大孔吸附树脂柱吸附，上样量为0.5 1BV，流速为0.5 lBV/h。完全吸附后，以蒸馏水5 8BV充分洗去杂质，10%こ醇1(T15BV解吸目标化合物，收集解析液，浓缩至干回收こ醇并得到固形物，上述所用树脂包括D101，HPD100, AB-8和ADS-17广谱非极性大孔吸附树脂。(5)溶剂抽提纯化:将树脂富集纯化后得到的固形物加入蒸馏水溶解，以等体积的こ酸こ酯为萃取溶剂，萃取:T5次，减压浓缩至干回收こ酸こ酯并得到富含表告伊春的粗品。(6)正相硅胶中压柱层析:所用样品为こ酸こ酯抽提纯化后所得到的粗品，所用硅胶为300100目。预先称取质量为样品量8 10倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂包括正己烷和こ酸こ酷。将样品用少量こ酸こ酯溶解，加入与样品质量相同的层析硅胶拌匀后在水浴锅上炒样至干，装入预先装好的层析硅胶柱上，先后以1(T20BV不同比例梯度的正己烷和こ酸こ酯溶液连续中压洗脱，收集洗脱液，每份l/4(Tl/20BV，利用TLC监测洗脱液成分，合并相同部分，TLC展开剂为正己烷:こ酸こ酷=20:广1:1。(7)低温析晶和重结晶:富含表告伊春的溶液经过低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度大于98%表告伊春纯品，所用溶剂为こ酸こ酯和甲醇，所用溶剂的比例为こ酸こ酷:甲醇=1:广5，低温析晶和重结晶的温度为-1025° C。本专利技术所述步骤(I)采用的匀浆破碎酶解技术与传统干燥样品粉碎技术相比，粉碎过程不产生粉尘，安全緑色，可将板蓝根在酶溶液中粉碎成组织细胞，并具有破坏细胞壁、使植物细胞和酶充分接触以及瞬时刺激诱发内源性酶活性的作用。本专利技术所述步骤(2)在恒温条件下进行负压空化提取兼具酶解和生物转化作用，由于植物细胞壁在植物次生代谢产物提取过程中是ー种天然的屏障，它是以纤维素为骨架，并以半纤维素、果胶和蛋白质等大分子聚合而成，単一的酶无法使细胞壁彻底破碎，利用外源混合酶(纤维素、半纤维素和果胶酶)将细胞壁成分水解或降解掉，破坏细胞壁结构，使有效成分充分游离出来，溶解、混悬或胶溶于提取溶剂中，加速胞内活性成分释放，同时经过内源酶的生物转化细胞内前体物质，使目标成分的含量得到提高。负压空化提取过程，是利用提取溶液内部局部压カ降低时，在液体内部或液固交界面上会形成和发展空化泡，由于这些空化泡瞬间(微秒级)溃灭会产生极高的压强，并且反复进行，从而对固体材料表面造成极大的破坏，同时利用其強烈的机械振动，加速了胞内活性成分的释放、扩本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术涉及一种从板蓝根中提取、分离和纯化表告伊春的方法，其主要特征在于：以干燥的板蓝根为原料，采用匀浆破碎酶解技术、酶辅助负压空化提取技术，絮凝除杂技术，大孔吸附树脂富集分离技术，溶剂抽提纯化技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效提取、分离和纯化技术手段得到纯度达98%以上的表告伊春。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付玉杰，罗猛，焦骄，盖庆岩，魏福尧，李吉，彭霄，
申请(专利权)人：东北林业大学，付玉杰，
类型：发明
国别省市：
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