本发明专利技术公开了一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，属于微生物发酵制药领域。本方法将制备得到的多孔陶瓷用发酵液进行处理后干燥待用；将纤维堆囊菌分别经M26固体、液体培养基培养后，得到菌悬液；将菌悬液稀释后接种于发酵液中，再向其中加入经处理过的多孔陶瓷，振荡培养。本发明专利技术提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生产菌株的方法，在埃博霉素B发酵生产时，通过对其生产菌株纤维堆囊菌进行固定，这样可以为在液体环境中生长的粘细菌细胞提供一个固体附着面，本方法能够提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本，操作步骤简单易行，可以放大至工业化生产，为埃博霉素的工业化生产奠定了实验基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纤维堆囊菌发酵
，涉及。
技术介绍
埃博霉素B (Epothilone B, EP0-906)是由纤维堆囊菌产生的一种已进入临床抗肿瘤治疗研究的药物。目前埃博霉素的发酵产量很低，主要由两个原因。第一是埃博霉素对其生产菌株有毒性抑制作用，这在很大程度上限制了埃博霉素的发酵产量。虽然可以利用大孔吸附树脂XAD-16来解决这方面的困难，但树脂对发酵液中其他物质的非特异性吸附也为埃博霉素产量的提高带来新的困难。第二，纤维堆囊菌复杂的细胞行为。它们往往在固体培养基上能良好的生长、代谢并产生埃博霉素，但在液体培养基中生长时代谢行为往往会发生改变；如细胞·成团生长，并且内外细胞的状态不一致；细胞存在自溶性现象；代谢状态不稳定等。因此开发一种能够作为埃博霉素生产菌株的固体化材料，并将其用于发酵液中将极大地增加埃博霉素的产量。多孔陶瓷作为一种新型陶瓷材料，一直倍受生物、环保领域科研人员的青睐，这是因为它作为生物催化剂的载体具有气孔率高、化学稳定性好、比表面积大、体积密度小以及耐高温、耐腐蚀等特点，另外多孔陶瓷还具备无毒害作用、稳定性优异、传质性能好、机械强度高、生物亲合性好、操作简单、价廉易得等优点。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供，为纤维堆囊菌生产埃博霉素B提供生长代谢的固体附着面，从而提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本。为达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现，包括以下步骤I)将纤维堆囊菌接种于M26固体培养基上培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中，振荡培养；2)将经M26液体培养基培养后的液体，高速搅拌使菌体均匀打散后，离心收集沉淀，加入无菌水重悬得纤维堆囊菌到菌悬液；3)按IOOmL发酵液接种5 IOmg菌种的比例,将纤维堆囊菌菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50 400倍经发酵液浸泡处理过的硅藻土基多孔陶瓷材料块，在25 35°C，180 220rpm 摇床培养 72 96h。所述在温度28 30°C，转速180 200r/min下摇床培养72 96h。所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌ATCC25532。所述在M26固体培养基上培养时其培养条件为30°C下，恒温培养箱中培养72 96h ；所述在M26液体培养基上培养时其培养条件为30°C，200rpm摇床振荡培养72 96h。步骤2)所述的高速搅拌时间为10 20min。步骤2)和步骤3)所述的离心过程是在4°C下,8000rpm,离心lOmin。所述的多孔陶瓷的孔径在5 10 μ m,比表面积为40 50m2/g,能够吸附固定粘细菌。所述的多孔陶瓷抗折强度为15 20MPa，吸水率达到50%。所述的多孔陶瓷的处理为多孔陶瓷块经150°C高温灭菌10 30min，自然冷却后，加入发酵液完全覆盖多孔陶瓷块并高出10 50mm，常温下摇晃O. 5 lh，静置I 2h后倾去发酵液，100 105°C干燥后待用。所述的多孔陶瓷块在发酵时悬浮在发酵液中。所述的IOOmL发酵液中多孔陶瓷块的加入量为I 2g。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果本专利技术的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，在埃博霉素B发酵生产时，通过添加硅藻土基多孔陶瓷对生产菌株纤维堆囊菌提供附着物，帮助其在培养液中固定，这样可以为在液体环境中生长的粘细菌细胞提供一个固体附着面，从一定程度上满足粘细菌生长代谢产生埃博霉素的 固体培养微环境，克服游离发酵培养时成团成片生长所带来的传质不均匀、代谢不稳定等难题。进一步，本专利技术的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，埃博霉素生产菌株被硅藻土基多孔陶瓷固定，也有利于缓解埃博霉素对其生产菌株的反馈抑制作用，从而提高发酵产量，降低抗肿瘤药物埃博霉素的生产成本，本专利技术的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，从所要固定的微生物菌体粘细菌聚集扩展的生长特点出发，所采用的硅藻土基多孔陶瓷的孔径在5 10 μ m，抗折强度为15 20MPa，比表面积为40 50m2/g，吸水率达到50%，能够良好的吸附固定粘细菌，吸附量达到了 10 15mg/g，并且在吸附固定粘细菌过程中磨损较少。本专利技术的基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，简单易行，可以进行工业化操作，为埃博霉素的工业化生产奠定了现实性基础。具体实施例方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术提供硅藻土基多孔陶瓷吸附固定埃博霉素生产菌株的方法，从所要固定的微生物菌体粘细菌聚集扩展的生长特点出发，选择合适的硅藻土基多孔陶瓷，孔径在5 10 μ m，抗折强度为15 20MPa，比表面积为40 50m2/g，吸水率达到50%。进一步，给出以下制备方法I)称取过60目筛的生娃藻土 40g,煅烧娃藻土 35g,粘土 15g,混合后加入20g水，在球磨机中球磨30min，将得到的浆液倒入搪瓷盘中，于105°C下干燥过夜。2)将干燥后的料浆研磨后过40目筛，再加入过80目筛的木屑lg，石蜡Ig进行混合后过40目筛3次,使其混合均匀；缓慢喷洒2g水后过3次40目筛，进行整粒，装入密封袋密封静置3h。3)将经整粒的混合粉料用粉末压片机在5MPa下压制尺寸为Φ 10X 20mm样品；4)将成型后的样品在300 C干媒3h后，放入电阻炉中1000 C保温30min使造孔剂(木屑和石蜡)挥发，得到硅藻土基多孔陶瓷。基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌的埃博霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤1.多孔陶瓷的前处理将尺寸为Φ20 X IOmm的硅藻土基多孔陶瓷块于150°C高温灭菌30min，自然冷却。将维堆囊菌发酵用发酵液加到多孔陶瓷样品中，完全覆盖样品后高出约50_，常温下缓慢摇晃lh，静置2h后倾去发酵液，多孔陶瓷干燥待用。2.菌悬液制备将一环新鲜的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)接种于M26固体培养基上，30°C恒温培养箱中培养72 96h ;将培养后的菌体接入IOOmL的M26液体培养基中，30°C，200rpm摇床培养72 96h ;培养结束后倒弃一部分液体，将剩余的液体转移至含有搅拌子和玻璃珠的三角瓶中，磁力搅拌器上高速搅拌10 20min，使菌团打散打匀为止，离心收集打勻的菌体，重悬于30 50mL的无菌水中，形成菌悬液。用无菌水将菌悬液稀释10 20倍后，离心收集沉淀，沉淀烘干后称干重，可得菌悬液稀释后的浓度，再换算成原来菌悬液的浓度，单位为mg/mL。在进行下一步发酵培养时可以按照一定的接种量来量取菌悬液，防止接种量过大而引起的传质不良或溶氧不足等现象的发生。3.发酵培养按IOOmL接种5 IOmg菌种的比例,将纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50 400倍预处理过的多孔陶瓷，在25 35°C，180 220rpm摇床培养72 96h。以上所用到的菌种、培养基具体为所述的菌种为纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)即可,具体的可选用纤维堆囊菌ATCC25532。M26固体培养基成分为琼脂20g/L，土豆淀粉8. 0g/L，大豆蛋白胨2. 0g/L，葡萄糖2. 0g/L，酵母粉 2. 0g/L,本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将纤维堆囊菌接种于M26固体培养基上培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中，振荡培养；2）将经M26液体培养基培养后的液体，高速搅拌使菌体均匀打散后，离心收集沉淀，加入无菌水重悬得纤维堆囊菌到菌悬液；3）按100mL发酵液接种5～10mg菌种的比例，将纤维堆囊菌菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50～400倍经发酵液浸泡处理过的硅藻土基多孔陶瓷材料块，在温度25～35℃，180～250r/min摇床培养72～96h。
【技术特征摘要】
1.一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将纤维堆囊菌接种于M26固体培养基上培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中，振荡培养； 2)将经M26液体培养基培养后的液体，高速搅拌使菌体均匀打散后，离心收集沉淀，力口入无菌水重悬得纤维堆囊菌到菌悬液； 3)按IOOmL发酵液接种5 IOmg菌种的比例,将纤维堆囊菌菌悬液接种于发酵液中，然后加入菌种质量50 400倍经发酵液浸泡处理过的硅藻土基多孔陶瓷材料块，在温度25 35°C，180 250r/min 摇床培养 72 96h。2.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述在温度28 30°C，转速180 200r/min下摇床培养72 96h。3.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌ATCC25532。4.根据权利要求1所述的一种基于多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵的方法，其特征在于，所述在M26固体培养基上培养时其培养条件为30°C下，恒温培养箱中培养72 96h ； 所述在M26液体培养基上培养时其培养条件为30°C，200rpm摇床振荡培养72 96h。5.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚国利，刘丽丽，王娜，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：
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