一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法技术

本发明专利技术公开了一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法。该类染料通过多步化学合成，最终使吲哚方酸菁含有带阳离子型的胺类官能团，提高了方酸菁的水溶性和生物相容性。该类荧光分子能与细胞核内的DNA或细胞膜中的磷脂分子相互作用，从而特异性标记活细胞的细胞膜和固定/死细胞的细胞核。结合这两种细胞标记特性，该类荧光染料成功地标记出活体组织中正在发生凋亡的细胞的细胞核。本方法合成工艺成熟、操作简单，产品具有安全无毒、分子可设计性强、水溶性优异、光稳定性好、pH敏感等优点，可作为多功能细胞荧光标记分子，应用于生物医药领域的科学研究、诊断和生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于有机染料合成及生物细胞标记领域，特别涉及一种结构可设计的阳离子型胺基功能化的方酸菁的合成方法。
技术介绍
菁染料是一类比较特殊的染料，与传统染料不同，它不能用于织物的染色，因为它在光照下不稳定。事实上，在最初的研究阶段，菁染料在很长时间内，都是作为一种感光材料，用作卤化银凝胶的增感剂。至今它在感光材料领域的应用仍然占据着重要地位，特别是近年来它作为新型光存储介质在有机型存储光盘中得到广泛应用。例如在CD—ROM光盘感光层材料中，菁染料是目前最常用三种染料之一。为了满足日新月异的生物分析应用对荧光染料的需求，研究开发出更多的具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料，仍然是荧光分析技术发展的关键和核心。目前使用比较多的罗丹明类、荧光素类、BODIPY类和菁类等荧光染料，其中有些品种已经商品化。但这些商品化的染料大部分光谱都处在紫外可见区，而生物样品自身在这个区域有很强的吸收，荧光检测时会显现出一定强度的自发荧光，造成强的荧光背景，从而极大地降低了检测的灵敏度。近红外荧光染料由于能避开这个问题近年来受到了广泛的重视。吲哚菁染料是菁染料中光稳定性比较突出的一类，吲哚方酸菁染料又是吲哚菁染料到目前为止光稳定性最好的一类。并 且吲哚方酸菁染料在近红外区有着强烈而狭窄的吸收和发射光谱，这些特点使得它在光电领域成为研究的热点。但是，吲哚方酸菁染料易于聚集，水溶性较差等缺点限制了其在生物上的广泛应用。因此，迫切需求专利技术新型的可以进行细胞特异性荧光标记的吲哚方酸菁染料，并将其应用于生物医药的科研、诊断等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类光稳定性好、水溶性好、pH敏感性、结构可设计性的胺基功能化吲哚方酸菁染料，具有细胞标记的多功能性。该方法首先通过成熟的合成方法制备具有羧基官能团修饰的吲哚方酸菁染料，然后通过羧基与胺基的缩合反应引入带有不同胺基官能团的结构，最终得到不同胺基官能团修饰的吲哚方酸菁染料。带有不同胺基官能团的吲哚方酸菁染料与活体或者固定/死细胞组织一同培养，应用于固定/死细胞的细胞核或者活体细胞的细胞膜的特异性生物标记，以及鉴定活体组织中正在发生凋亡的细胞。，其特征在于，其具体制备步骤为I)将苯肼盐酸盐类化合物和3-甲基-2-丁酮加入反应瓶中，摩尔比在1:0. 1-1:6之间，并加入溶剂冰醋酸，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应3-24小时，得到3H-吲哚啉产物；2)将3H-吲哚啉和含羧酸的烷基化试剂加入反应瓶中，摩尔比在1:0. 1-1:6之间，并加入溶剂乙腈或邻氯苯或甲苯，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应6-48小时，得到季铵化的吲哚啉衍生物；3)将季铵化的吲哚啉衍生物和方酸加入反应瓶，其摩尔比在1:0. 1-1:3之间，并加入溶剂体积比为正丁醇甲苯吡啶=1:1:1的溶剂，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ；溶液在氮气气氛下回流反应3-72小时，得到羧基功能化的吲哚方酸菁；4)将羧基功能化的吲哚方酸菁、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和二异丙基乙胺(DIPEA)加入反应瓶，其摩尔比在1:2:2-1:10:40之间，并加入N-二甲基甲酰胺(DMF)或三氯甲烷，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮气气氛下室温搅拌5-60 min，然后加入带有伯胺基的反应试剂；该反应试剂与方酸菁的摩尔比在1:1-1:30之间，反应0. 5-12小时得到胺基功能化的吲哚方酸菁染料。当胺基功能化的吲哚方酸菁染料为将叔丁酯Boc保护的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料，还需要进行以下步骤将叔丁酯Boc保护的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料加入反应瓶，并加入溶剂二氯甲烷或氯仿，使得溶液的溶度在10_2_10 mol/L ;然后往溶液中加入三氟乙酸,其与溶剂的体积比为1:1 ;在氮气气氛下室温搅拌2-8小时，得到伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料。所述合成方法合成的染料的应用，其特征在于将胺基功能化的吲哚方酸菁染料稀释到缓冲液中，放入活体或者固定/死细胞组织中培养一段时间后，该类荧光分子和细胞核里的DNA或细胞膜里的磷脂分子极性头部相互作用，从而能够特异性标记活体细胞的细胞膜和固定/死细胞的细胞核；结合这两种细胞标记特性，该类突光染料成功地标记出活体组织中正在发生细胞凋亡的细胞核。这种标记后的细胞组织可以制备成玻片样本在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下拍照分析后，长期冷冻保存。步骤4)中所述的胺基功能化的吲哚方酸菁染料的结构式为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法，其特征在于，其具体制备步骤为：1）将苯肼盐酸盐类化合物和3?甲基?2?丁酮加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1?1:6之间，并加入溶剂冰醋酸，使得溶液的浓度在10?2?10?mol/L；溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应3?24小时，得到3H?吲哚啉产物；2）将3H?吲哚啉和含羧酸的烷基化试剂加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1?1:6之间，并加入溶剂乙腈或邻氯苯或甲苯，使得溶液的浓度在10?2?10?mol/L；溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应6?48小时，得到季铵化的吲哚啉衍生物；3）将季铵化的吲哚啉衍生物和方酸加入反应瓶，其摩尔比在1:0.1?1:3之间，并加入溶剂体积比为正丁醇:甲苯:吡啶=1:1:1的溶剂，使得溶液的浓度在10?2?10?mol/L；溶液在氮气气氛下回流反应3?72小时，得到羧基功能化的吲哚方酸菁；4）将羧基功能化的吲哚方酸菁、2?(7?偶氮苯并三氮唑)?N,N,N“,N“?四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和二异丙基乙胺(DIPEA)加入反应瓶，其摩尔比在1:2:2?1:10:40之间，并加入N?二甲基甲酰胺（DMF）或三氯甲烷，使得溶液的浓度在10?2?10?mol/L；溶液在氮气气氛下室温搅拌5?60?min，然后加入带有伯胺基的反应试剂；该反应试剂与方酸菁的摩尔比在1:1?1:30之间，反应0.5?12小时得到胺基功能化的吲哚方酸菁染料。...

【技术特征摘要】
1.一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法，其特征在于，其具体制备步骤为 1)将苯肼盐酸盐类化合物和3-甲基-2-丁酮加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1-1:6之间，并加入溶剂冰醋酸，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应3-24小时，得到3H-吲哚啉产物； 2)将3H-吲哚啉和含羧酸的烷基化试剂加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1-1:6之间，并加入溶剂乙腈或邻氯苯或甲苯，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应6-48小时，得到季铵化的吲哚啉衍生物； 3)将季铵化的吲哚啉衍生物和方酸加入反应瓶，其摩尔比在1:0.1-1:3之间，并加入溶剂体积比为正丁醇甲苯吡啶=1:1:1的溶剂，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮气气氛下回流反应3-72小时，得到羧基功能化的吲哚方酸菁； 4)将羧基功能化的吲哚方酸菁、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和二异丙基乙胺(DIPEA)加入反应瓶，其摩尔比在1:2:2_1:10:40之间，并加入N-二甲基甲酰胺(DMF)或三氯甲烷，使得溶液的浓度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮气气氛下室温搅拌5-60 min，然后加入带有伯胺基的反应试...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹梅贞，李杰，郭坤茹，杨万泰，孙盟盟，沈杰，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：