一种生物膜及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种分离的生物膜及其制备方法和应用；进一步的，本发明专利技术提供了一种利用该生物膜刺激T淋巴细胞增殖的方法及其应用；更进一步的，本发明专利技术提供了一种包含该生物膜的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，尤其是细胞免疫领域，具体涉及一种激活T淋巴细胞并促进T淋巴细胞增殖的试剂及方法。该试剂及方法可应用于临床细胞免疫治疗，也可用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用的研究。
技术介绍
T淋巴细胞是人体最重要的免疫细胞之一，由胸腺内的淋巴干细胞分化而来，成熟后迁移到外周血；按其功能可分为三个亚群辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T淋巴细胞的正常功能对于维护机体的健康及其重要，它们的缺陷和功能异常可导致包括自身免疫性疾病和肿瘤等在内的各种疾病。目前，免疫学研究包括各种对T淋巴细胞的 基础和临床应用的研究日益深入且发展迅速，在人T细胞来源和数量受限的现实情况下，对T细胞的需求日益迫切。因此，有必要建立一个有效，方便的体外T细胞活化和增殖方法来获取大量具功能活性的T细胞以满足需求。近年来，随着过继性细胞免疫治疗恶性肿瘤的迅速发展，对体外T细胞活化和增殖的科研和临床需求越来越大。众所周知，尽管包括手术，化疗和放疗等综合手段的应用对恶性肿瘤的治疗取得了一定的进步，但是，上述传统治疗手段对恶性肿瘤的疗效总体来说还很不理想。寻求各种新药物、新技术、新方法来治疗恶性肿瘤不仅势在必然，而且现代医学的进步也为新治疗手段的发展提供了可能。其中一个极具潜能并在近期取得突破性进展的手段就是过继性T细胞免疫治疗法。这种治疗手段是将分离得到的患者自身的各种T细胞，包括周围血效应性(⑶8+或⑶4+) T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)，自然杀伤细胞样T淋巴细胞(CIK)等，在体外通过各种手段如基因改造，肿瘤抗原刺激，细胞因子诱导等激活T细胞，再回输至患者体内以发挥其直接杀灭肿瘤细胞和激发抗肿瘤免疫反应等作用而达到治疗目的。也由于患者T细胞来源和数量受限，因此，建立一个有效的体外培养系统来活化和增殖上述各种T细胞，以满足过继性T细胞免疫治疗需求，是极为必要的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是常规淋巴细胞扩增方法得到的淋巴细胞细胞增殖倍数和细胞毒活性不够理想的问题，并针对该问题提供一种用于淋巴细胞活化及扩增的方法及试剂盒。本专利技术第一方面提供了一种分离的生物膜，该生物膜可以用于装载生物活性分子。进一步地，该生物膜包含抗生物素蛋白Avidin。本专利技术第二方面提供了生物膜的制备方法，是通过裂解能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞获得所述的生物膜。优选地，本专利技术所述的生物膜的制备方法，包含以下步骤1)获得能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞； 2)获得步骤I)所述细胞的细胞裂解液； 3)离心获得权利要求1所述的生物膜，并使其均质化。优选地，所述均质化方法为超声波法。优选地，所述细胞为纤维母细胞。进一步优选地，所述生物膜制备方法包含以下步骤 1)获得稳定表达抗生物素蛋白Avidin的纤维母细胞； 2)获得步骤I)所述纤维母细胞的细胞裂解/缓冲液，将裂解液置于冰上20分钟； 3)4°C条件下，720 G离心5分钟，取上清； 4)4°C条件下，将上清以10，000 G离心5分钟，取上清； 5)4°C条件下，将上清以100，000 G离心60分钟，取沉淀； 6)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，4°C条件下以100，000G将沉淀离心45分钟，取沉淀； 7)4°C条件下，将所得沉淀继续以100，000G离心45分钟，取沉淀； 8)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，用35%强度的超声波处理I分钟，使其均质化，获得所述的生物膜。35%强度的超声波是指45 Watt，20 KHz的超声波(Q125超声波仪，美国Qsonica)。本专利技术第三方面提供了一种刺激淋巴细胞增殖的方法，该方法包含以下步骤 1)获得上述任一项所述的生物膜； 2)使生物膜与一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子形成复合物； 3)使生物膜-淋巴细胞增殖刺激因子复合物与淋巴细胞接触。优选情况下，所述的刺激淋巴细胞增殖的方法还包括使淋巴细胞进一步与白细胞介素-2 (IL-2)接触。优选情况下所述淋巴细胞为T淋巴细胞；所述淋巴细胞增殖刺激因子选自⑶3抗体、⑶86、4_1BBL中的一种或多种。需要说明的是，本专利技术的生物膜可通过抗生物素蛋白Avidin与生物素偶联的各种生物活性分子结合，将生物活性分子转运到合适的位置，促进其发挥生物学功能。本专利技术第四方面提供了上述所述的生物膜在刺激淋巴细胞增殖中的应用，优选地淋巴细胞为T淋巴细胞。T淋巴细胞包括⑶3+淋巴细胞，⑶4+淋巴细胞，⑶8+淋巴细胞和Treg调节性T淋巴细胞。本专利技术还提供了一种刺激淋巴细胞增殖的试剂盒，包含上述的生物膜或通过上述方法制备的生物膜。优选地，该试剂盒还包含一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子，进一步优选地，淋巴细胞增殖刺激因子为生物素偶联的淋巴细胞增殖刺激因子；进一步优选地，试剂盒还包含白细胞介素_2。在另一种优选情况下，所述淋巴细胞为T淋巴细胞；所述淋巴细胞增殖刺激因子选自⑶3抗体、⑶86、4_1BBL中的一种或多种。有益效果 本专利技术提供的生物膜可以和悬浮培养的T淋巴细胞相互粘附，充分提高生物活性分子和T淋巴细胞相互作用的效应。此外，在细胞培养条件下，生物膜可以被有效地自然降解，对T淋巴细胞无任何不良副作用，并能最大程度简化T淋巴细胞活化和扩增的培养程序和步骤，避免了类似产品中需要清除用以吸附生物活性分子的磁珠而导致的额外步骤和污染机会。本专利技术提供的方法具有操作简便、高效地活化和增殖T细胞等特点；本专利技术提供的试剂盒具有成本低、易于规模化生产等突出优势，可用于淋巴细胞的基础研究及临床应用研究。附图说明下面结合附图对本专利技术做进一步描述 图1是通过流式细胞仪对T淋巴细胞表型进行检测的结果。图2是使用本专利技术提供的活化扩增试剂促进T淋巴细胞增殖的结果。具体实施例方式本专利技术提供了一种可以装载各种生物活性分子的生物膜材料，该生物膜材料具有细胞亲和力，可以和悬浮培养的T细胞相互粘附，从而能充分提高生物活性分子对T细胞的效应作用；该生物材料随后在自然培养条件下可被降解，对T细胞生长无任何毒副作用。现有的一些刺激淋巴细胞增殖的方法是通过应用磁珠来装载生物活性分子；磁珠是非生物材料，与T细胞缺乏亲和性，而且，在细胞培养中需要额外步骤清除磁珠。因此，与其相比较，本专利技术对体外T细胞的活化和增殖更加高效，操作更为简便。首先通过全基因合成法获得人源化修饰后的Avidin cDNA序列，并将该序列通过常规PCR方法克隆至真核表达载体中；通过脂质体法转染，将重组表达载体转染至细胞中，并通过抗生素筛选获得稳定表达人源化的Avidin的细胞株。下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不能用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、生物膜的制备1、构建稳定表达人源化Avidin (抗生物素蛋白)的纤维母细胞株(Fibroblast —Avidin) 1 )使用分子生物学方法获得人源化修饰后的Avidin cDNA (序列如GenBank:AJ616762.1),并将其构建于pcDNA3.1载体上，重组后的载体命名为p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的生物膜，其特征在于该生物膜可以用于装载生物活性分子。

【技术特征摘要】
1.一种分离的生物膜，其特征在于该生物膜可以用于装载生物活性分子。2.权利要求1所述的生物膜，其特征在于该生物膜包含抗生物素蛋白Avidin。3.权利要求1-2任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于通过裂解能够稳定表达重组抗生物素蛋白Avidin的细胞获得所述的生物膜。4.权利要求3所述的生物膜的制备方法，其特征在于包含以下步骤1)获得能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞；2)获得步骤I)所述细胞的细胞裂解液；3)离心获得权利要求1-2任一项所述的生物膜，并使其均质化。5.权利要求4所述的生物膜的制备方法，其特征在于所述均质化方法为超声波法。6.权利要求2-5任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于所述细胞为纤维母细胞。7.权利要求2所述的生物膜的制备方法，其特征在于包含以下步骤O获得稳定表达抗生物素蛋白Avidin的纤维母细胞；2)向步骤I)所述纤维母细胞加入细胞裂解/缓冲液，将裂解液置于冰上20分钟； 3)4°C条件下，720 G离心5分钟，取上清； 4)4°C条件下，将上清以10，000 G离心5分钟，取上清； 5)4°C条件下，将上清以100，000 G离心60分钟，取沉淀；6)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，4° C条件下以100，000G将沉淀离心45分钟，取沉淀； 7)4°C条件下，将所得沉淀继续以100，000G离心45分钟，取沉淀； 8)向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，用35%强度即45Watt，20 KHz的超声波处理I分钟，使其均质化，获得权利要求1所述的生物膜。8.一种刺激淋巴细胞活...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄纲雄，杨林，
申请(专利权)人：博生吉医药科技苏州有限公司，黄纲雄，
类型：发明
国别省市：