鉴定用于分化定型内胚层的因子的方法技术

本发明专利技术公开了鉴定一种或多种分化因子的方法，该分化因子可用于使包含定型内胚层细胞的细胞群中的细胞分化为能够形成源自肠管的组织和/或器官的细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学和细胞生物学领域，尤其涉及鉴定可用于分化定型内胚层细胞为其它细胞类型的因子。_5]
技术介绍
人多能性干细胞(pluripotent stem cell),如胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖细胞(EG)，于1994年首先从无成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Bongso et al.，1994)，1997年从含成纤维细胞饲养层的培养物中分离(Hogan, 1997)。随后Thomson、Reubinoff和Shamblott建立了采用有丝分裂失活的小鼠饲养层连续培养人ES和EG细胞的方法(Reubinoff et al. , 2000;Shamblott et al. , 1998;Thomson et al.，1998)。人ES和EG细胞(hESC)为研究人类早期发育和为治疗性干预一些疾病状态(如糖尿病和帕金森氏症)提供了极难得的机会。例如，在采用细胞疗法治疗糖尿病的过程中，使用衍生自hSEC的产生胰岛素的β细胞会比目前利用来自供者胰腺的细胞治疗糖尿病有很大进步。但目前还不知道如何从hSEC得到产生胰岛素的β细胞。因此，目前利用来自供者胰腺的胰岛细胞治疗糖尿病的细胞疗法受限于缺乏移植所需的高质量胰岛细胞。对单一I型糖尿病人的细胞治疗需要移植大约8 X IO8胰岛细胞(Shapiro et al.，2000; Shapiroet al. , 2001a; Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰岛细胞至少需要两个健康供者的器官提供。而人胚胎干细胞为开发用于人类细胞治疗的大量的高质量分化细胞提供了起始材料的来源。多能性和能够维持hSEC细胞较长时间培养这两个性质使其特别适合用于细胞治疗。多能性是指hESC能够分化为所有3种主要胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物，进而在除胚胎外组织(如胎盘)和生殖细胞外还形成成熟器官的所有体细胞类型的能力。尽管多能性赋予了 hSEC特殊的用途，但这个性质也给这些细胞及其衍生物的研究和控制带来挑战。由于在分化hSEC培养基中会产生大量细胞类型，所以大部分细胞类型产生效率很低。而且，成功评价任一指定细胞类型的产生关键取决于定义合适的标志物。高效、定向的分化对hESCs的治疗性应用非常重要。 解决上述问题对利用hSEC作为起始材料生产用于细胞治疗应用的细胞有利。此夕卜，其还有利于鉴定促进衍生自hESCs的前体细胞分化为用于细胞治疗的细胞类型的因子。专利技术概要本专利技术的实施方案涉及鉴定一种或多种分化因子的方法，该分化因子可用于分化细胞群中的细胞成为可用于细胞治疗的细胞，该细胞群包含roxi-阳性(表达roxi的)内胚层细胞和/或roxi-阴性内胚层细胞(不显著表达roxi的内胚层细胞)，如定型内胚层细胞。举例来说，本文所述方法的一些实施方案涉及鉴定能够促进定型内胚层细胞分化为组织和/或器官的前体细胞的因子，这些组织和/或器官包括但不限于胰腺、肝、肺、胃、肠、甲状腺、胸腺、咽、胆囊和膀胱。在一些实施方案中，这些前体细胞是roxi-阳性内胚层细胞。在其它实施方案中，这些前体细胞是不显著表达roxi的内胚层细胞。在本文所述方法的一些实施方案中，定型内胚层细胞的细胞培养物或细胞群与候选(测试)分化因子接触或以其它方法提供候选(测试)分化因子。在优选的实施方案中，定型内胚层细胞是人定型内胚层细胞。在更优选的实施方案中，该人定型内胚层细胞是可分化成肠管或衍生自肠管的器官的细胞的多潜能细胞。在本文所述方法的其它实施方案中，PDXl-阳性内胚层细胞的细胞培养物或细胞群与候选(测试)分化因子接触或以其它方法提供候选(测试)分化因子。在优选的实施方案中，roxi-阳性内胚层细胞是人roxi-阳性内胚层细胞。在某些实施方案中，该人PDXi-阳性内胚层细胞是roxi-阳性的前肠/中肠内胚层细胞。在更优选的实施方案中，该人roxi-阳性内胚层细胞是roxi-阳性的前肠内胚层细胞。在其它优选的实施方案中，该人roxi-阳性内胚层细胞是前肠后部的roxi-阳性内胚层细胞。在特别选的实施方案中，该人roxi-阳性前肠内胚层细胞是可分化成衍生自肠管前部的细胞、组织或器官的多潜能细胞。涉及本文所述方法时，候选分化因子可能是已知引起细胞分化的因子或未知引起细胞分化的因子。在某些实施方案中，候选分化因子可以是多肽，例如生长因子。在一些实施方案中，该生长因子包括但不限于FGF10、FGF4、FGF2、Wnt3A或Wnt3B。在其它实施方案中，候选分化因子可以是小分子。在具体实施方案中，该小分子是类视黄醇化合物，如视黄酸。或者，在一些实施方案中，候选分化因子不是类视黄醇，不是前肠分化因子或不是TGF β超家族的成员。在其它实施方案中，候选分化因子是除类视黄醇化合物、前肠分化因子或TGF^超家族成员之外的任何分子，如活化素(activin)A和B。在其它实施方案中，候选分化因子是之前未知引起定型内胚层细胞分化的因子。本文所述方法的其它实施方案涉及在众多浓度下测试候选分化因子。例如，候选分化因子可能只在浓度高于特定阀值时引起定型内胚层细胞和/或roxi-阳性内胚层细胞的分化。另外，当以低浓度提供时，候选分化因子可以使细胞分化成第一细胞类型，而当以更高浓度提供时可使同样细胞分化成第二细胞类型。在一些实施方案中，候选分化因子以约O. lng/ml至约10mg/ml范围内的一个或多个浓度提供。在使包含定型内胚层细胞和/或roxi-阳性内胚层细胞的细胞培养物或细胞群接触或以其它方式提供候选分化因子之前或大约同时，选定并评估至少一种标志物以确定其表达。这一步骤可称为第一标志物评估步骤。或者，这一步骤可称为在第一时间点确定标志物的表达。标志物可以是可用于监测细胞分化的任何标志物，但是，优选的标志物包括但不限于性别决定区Y-盒17 (S0X17)、胰-十二指肠同源框因子-I (PDXl)、白蛋白、肝细胞特异性抗原(HSA)、普洛斯彼罗-相关同源框I (prospero-related homeobox 1，PR0X1)、甲状腺转录因子l(TITFl)、绒毛蛋白、α-甲胎蛋白(AFP)、细胞色素Ρ4507A(CYP7A)、酪氨酸转氨酶(TAT)、肝细胞核因子4a (HNF4a)、CXC型趋化因子受体4 (CXCR4)、血管性血友病因子(VMF)、血管细胞粘附分子(VACMl)、载脂蛋白Al (APOAl)、葡萄糖转运蛋白(GLUT2)、α-I-抗胰蛋白酶(AAT)、葡萄糖激酶(GLUKO)和人造血表达同源框(humanhematopoietically expressed homeobox, hHEX)和 CDX2。从使包含定型内胚层细胞和/或roxi-阳性内胚层细胞的细胞培养物或细胞群接触或以其它方式提供候选分化因子算起经过足够的时间后，再次评估至少一个标志物在细胞培养物或细胞群中的表达。这一步骤可称为第二标志物评估步骤。或者，这一步骤可称为在第二时间点确定标志物的表达。在优选的实施方案中，在第一和第二时间点评估的标志物是相同标志物。在本文所述方法的一些实施方案中，进一步确定该至少一个标志物在第二时间点的表达与其在第一时间点的表达相比是否增加或减少。该至少一个标志物表达的增加或减少表明该候本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养基，其包含低于10%的血清和至少100ng/ml选自TGFβ超家族的Nodal/活化素亚群、TGFβ超家族的BMP亚群或者Wnt家族成员的至少一种生长因子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：凯文·艾伦·达穆尔，艾伦·D·阿古尼克，苏珊·埃利泽，伊曼纽尔·贝特格，
申请(专利权)人：维亚希特公司，
类型：发明
国别省市：