一种纳米微球时间分辨荧光探针及其制备方法和用途技术

本发明专利技术属于检测技术领域，具体涉及一种纳米微球时间分辨荧光探针及其制备方法和用途。本发明专利技术公开了一种纳米微球时间分辨荧光探针，为一高分子材料包裹稀土元素荧光配合物的纳米微球，其特征在于稀土元素荧光配合物包括下列摩尔比的物质：稀土元素离子∶β-二酮体类螯合剂∶荧光增强协同剂＝1∶4∶5，其中所述稀土元素离子为Eu3+和其他镧系离子以100∶1-1000∶1摩尔比的双掺混合物。

【技术实现步骤摘要】
一种纳米微球时间分辨荧光探针及其制备方法和用途
本专利技术属于检测
，具体涉及一种纳米微球时间分辨荧光探针及其制备方法和用途。
技术介绍
时间分辨荧光分析法(Timeresolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，TRFIA是用稀土离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，与其螯合剂、增强液(有一部分不需要)在待反应体系(如：抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在食品检测、医学临床检测、生物学科研检测以及环境检测等方面有较为广泛的应用。由于稀土元素络合物的荧光强度都较低，因此需要采用荧光增强技术来提高检测灵敏度。目前，根据信号增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型，(1)解离再增强技术(DELFIA)；(2)CyberFluor系统；(3)基于纳米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。其中，Nano-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了稀土元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，将稀土元素及其配合物共同掺杂在纳米及微球上，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围，其实际性能不低于DELIFA技术。CN02144517公开了一种强荧光性稀土荧光纳米微粒(LanthanideFluorescenceNanoparticles，简称LFNP)的制备及其在生物检测技术中的应用方法。它以强荧光性稀土配合物为发光中心，采用硅胶化学包裹成粒技术制备而成。CN03133857公开了一种β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用，是由可与硅酸酯共聚合的单体，与三价铕-β-二酮类荧光配合物于有机溶剂中发生共价键合反应，然后其再与硅酸酯发生共聚，形成的功能性纳米稀土荧光微粒；所述三价铕离子、β-二酮有机配位体、可与硅酸酯共聚合的单体及硅酸酯，它们之间的摩尔比例为1∶2～3∶10～100∶350～450。但现有的稀土元素荧光探针仍存在荧光强度较低、易发生光漂白的缺陷。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有稀土元素荧光探针荧光强度不够等缺陷。为此，本专利技术公开了一种纳米微球时间分辨荧光探针，为一高分子材料包裹稀土元素荧光配合物的纳米微球，其特征在于稀土元素荧光配合物包括下列摩尔比的物质：稀土元素离子∶β-二酮体类螯合剂∶荧光增强协同剂＝1∶4∶5，其中所述稀土元素离子为Eu3+和其他镧系离子以100∶1～1000∶1摩尔比的双掺混合物。在一些实施例中，所述高分子材料优选为聚苯乙烯或聚烷基氰基丙烯酸酯，最优选为聚苯乙烯。在一些实施例中，所述纳米微球的粒径为10-200nm、表面电荷SurfaceCharge(μeq/g)为170-200，羧基密度ParkingArea为(sq.A/grp)为25-35.7。在一些实施例中，所述β-二酮体类螯合剂为β-萘甲酰三氟丙酮。在一些实施例中，所述荧光增强协同剂为三辛基氧化膦和菲罗啉，其中摩尔比为三辛基氧化膦∶菲罗啉＝2∶2。在一些实施例中，所述其他镧系离子为Sm3+、Tb3+、Nd3+或Dy3+。另一方面，本专利技术公开了上述纳米微球时间分辨荧光探针的制备方法，包括下列步骤：高分子纳米微球的制备；纳米荧光微球的制备；纳米荧光微球抗体(或抗原)的标记。另一方面，本专利技术公开了上述纳米微球时间分辨荧光探针作为示踪物标记在食品检测、医学临床检测、生物学科研检测以及环境检测方面的用途。本专利技术所述的纳米微球时间分辨荧光探针具有荧光强度高、稳定性好、抗逆性强、检测样品兼容性大等优点，并且可以与免疫层析技术相结合，实现快速与定量的完美结合。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1羧基化聚苯乙烯纳米微球的制备取10mm苯乙烯单体和0.95mm丙烯酸单体溶解于10ml含0.45mm十二烷基磺酸钠的去离子水中，加入圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌均匀，然后用高纯氮气将圆底烧瓶中空气除尽，密封加热至70℃，加入0.5ml0.15mm的过硫酸钾，密封隔氧搅拌反应8h后，降至室温，然后将反应液用whatman2v滤纸(孔径8μm)过滤，，最后用透析袋(截留分子量30,000Da)对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％的叠氮钠4℃保存。通过测定，所制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球的直径为190±10nm，表面电荷SurfaceCharge(μeq/g)为170-200，羧基密度ParkingArea为(sq.A/grp)为25-35.7。实施例2纳米荧光微球的制备取少量实施例1中制备的190nm的聚苯乙烯微球，加入10ml去离子水和丙酮混合液中(v/v＝1∶1)，使反应液中聚苯乙烯微球的密度约为1×1014个，搅拌均匀，加入100ul0.1M的三氯化铕，1μl0.1M三氯化铽，400μl0.1Mβ-二酮(β-NTA)，300μl三辛基氧化膦(TOPO)，100μl菲罗啉，先加热至60℃恒温搅拌避光反应10h，然后降至室温反应2h，最后通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，对去离子水透析5天，去除其余剩余小分子物质，收集透析袋内液体，加入0.05％的叠氮钠4℃保存。通过测试和计算，平均每个纳米荧光微球中包裹的铕离子螯合物的数量约为18-20万个。实施例3不同包裹方法纳米荧光微球荧光强度的比较参照实施例2的配方和步骤分别制备未掺杂铽离子、掺杂铽离子未使用菲罗啉、未掺杂铽离子使用菲罗啉纳米荧光微球，进行荧光强度的比较，结果见表1。表1注：(1)荧光强度的定义为一个纳米微球激发后所产生的荧光强度相当于单个游离铕离子螯合物的所产生荧光强度的倍数；(2)商品化的荧光微球粒径为0.2μm，购自于ThermoFisherScientific，商品名为Fluoro-MaxCarboxylate-ModifiedandStreptavidin-CoatedEuropiumChelateParticles。实施例4纳米荧光微球标记三聚氰胺单克隆抗体的制备取少量实施例2中制备的纳米荧光微球，溶于10ml0.01MpH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL，400w超声处理30秒，然后缓慢加入200ul15mg/mL的碳二亚胺(EDC)，室温匀速搅拌温育15min后，150000g离心10分钟，收集沉淀，用0.01MpH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤离心2次即得活化的的荧光微球。将活化的荧光微球复溶于5ml0.01MpH8.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米微球时间分辨荧光探针，为一高分子材料包裹稀土元素荧光配合物的纳米微球，其特征在于所述稀土元素荧光配合物包括下列摩尔比的物质：稀土元素离子∶β?二酮体类螯合剂∶荧光增强协同剂＝1∶4∶5，其中所述稀土元素离子为Eu3+和其他镧系离子以100∶1?1000∶1摩尔比的双掺混合物。

【技术特征摘要】
1.一种纳米微球时间分辨荧光探针，为一高分子材料包裹稀土元素荧光配合物的纳米微球，其特征在于所述稀土元素荧光配合物包括下列摩尔比的物质：稀土元素离子:β-二酮体类螯合剂:荧光增强协同剂＝1:4:5，其中所述稀土元素离子为Eu3+和其他镧系离子以100:1-1000:1摩尔比的双掺混合物；所述纳米微球的粒径为10-400nm、表面电荷为170-200μeq/g，羧基密度为25-35.7sq.A/grp；所述β-二酮体类螯合剂为β-萘甲酰三氟丙酮；所述荧光增强协同剂为三辛基氧化膦和/或菲罗啉；所述其他镧系离子为...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖理文，张玲，郭文豪，王立，梁俊，张琪，
申请(专利权)人：上海优你生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：