本发明专利技术公开多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSNs)一种用途，即将其用于运载猪圆环病毒抗原PCV2GST-ORF2表位蛋白，这种纳米载体颗粒的直径为100～200nm，本发明专利技术同时公开多孔结构的空心球状硅纳米颗粒承载PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，即将具有所述的硅纳米颗粒溶于磷酸缓冲液中，再在其中加入PCV2GST-ORF2表位蛋白，使多孔结构的空心球状硅纳米颗粒充分吸咐蛋白。相关实验表明，用多孔结构的空心球状硅纳米颗粒作为猪圆环病毒抗原表位蛋白载体，可以实现猪圆环病毒抗原表位蛋白在免疫小鼠体内缓慢释放，持续刺激机体产生免疫应答的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种运载特定蛋白的载体，特别是一种可以运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米载体。
技术介绍
在基础研究和临床实验中均需要使用某种载体来运载化学药品或特定的蛋白，本领域的工作者仍在尝试寻找这一类的高效的运载工具。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病原之一，PCV2基因组编码11个阅读框架，其中了解比较清楚的ORF I由 945个碱基组成，编码参与病毒复制A的Rep蛋白；0RF2由705个碱基组成，编码病毒主要结构蛋白Cap，其在病毒感染诱导的免疫反应中起重要作用。研究表明，Cap蛋白中含有中和抗原表位，在对Cap和Rep蛋白的免疫原性比较中发现,Cap蛋白为主要免疫原,而Rep蛋白仅有微弱的免疫原性，因此，0RF2已成为目前构建PCV2重组疫苗的首选靶基因。近年来，研究者尝试用生物可降解材料制作的微粒，如藻酸盐微粒、聚乳酸微粒、 脂质体微粒等包裹并投递蛋白疫苗，初步研究发现微粒载体的应用可减少免疫次数，产生佐剂效应，增强免疫效果，提高免疫覆盖率。但研究也发现，用这些微粒做载体时，抗原包裹过程中所使用的有机溶剂会导致承载的蛋白质抗原变性而失活，而且这类微粒由于其粒径小，比表面积大，易于粘接与团聚，其次这类微粒的稳定性及抗原释放速率机制以及微粒的粒径大小、均匀程度、表面形态等参数均难以或还不清楚，这些缺点也限制了这类载体作为蛋白疫苗运载系统的广泛应用。具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSN)是一类具有多种优势的纳米材料， 这些优势包括无毒的自然属性、良好的表面穿透性、比表面积大、可调的孔结构、良好的物理化学稳定性以及可修饰的化学表面等，这些特性使中空多孔硅纳米颗粒(HMS N)成为运载多种化学物或药物的最佳载体。
技术实现思路
本专利技术提供硅纳米颗粒的用途，本专利技术的第二个目的是提供这种纳米颗粒承载猪圆环病毒PCV2GST-0RF2表位蛋白的方法。本专利技术所述的多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSNs)用途是将其用于运载猪圆环病毒抗原表位蛋白，而这种纳米载体颗粒的直径为100 200nm ;更进一步讲，本专利技术所述的运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米颗粒载体可在制备猪圆环病毒疫苗中应用。本专利技术所述的纳米载体在承载PCV2GST-0RF2表位蛋白时是将具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒溶于pH 7. O的磷酸缓冲液中配制成多孔结构的空心球状硅纳米颗粒的悬液，再在其中加入PCV2GST-0RF2表位蛋白，室温下充分搅拌，使多孔结构的空心球状硅纳米颗粒充分吸咐蛋白。本专利技术的纳米载体承载PCV2GST-0RF2表位蛋白的最佳方法是所配制的多孔结构的空心球状硅纳米颗粒悬液的浓度为10mg/mL，然后在IOmL悬液中加入O. 5mg的 PCV2GST-ORF2蛋白，使多孔结构的空心球状硅纳米颗粒充分进行吸咐PCV2GST-ORF2蛋白。本专利技术用多孔结构的空心球状硅纳米颗粒(HMSN)承载PCV2GST-0RF2表位蛋白， HMSN作为载体可有效防止蛋白酶对承载蛋白制剂的降解并使承载的蛋白缓慢释放，从而达到持久免疫刺激的效果，为提高疫苗的效力提供条件。相关实验表明，用多孔结构的空心球状硅纳米颗粒作为猪圆环病毒抗原表位蛋白载体，充分利用利用了空心球状硅纳米颗粒具有的高承载量和控释特性，可以实现猪圆环病毒抗原表位蛋白在免疫小鼠体内缓慢释放，持续刺激机体产生免疫应答的效果。相关的实验表明，与直接以PCV2GST-0RF2表位蛋白免疫小鼠相比，承载了 PCV2GST-0RF2表位蛋白的HMSN能够诱导持续的抗体免疫反应和较强的细胞免疫反应，而这种缓释特性在蛋白疫苗载体应用中的具有明显的优势。附图说明图1为本专利技术所使用的中空多孔硅纳米颗粒的电镜图，其中(a)为扫描电镜图， (b)为透视电镜的图，图中的纳米粒的直径大约为100 200nm。图2 为 SDS-PAGE 和 western-bloting 对纯化 GST-0RF2-E 蛋白的鉴定，图中A 图为纯化蛋白洗脱后的SDS-PAGE图，其中.Lane1:为第一次洗脱；Lane 2为第二次洗脱； Lane 3为第三次洗脱；B为用GST单克隆抗 体对纯化蛋白的鉴定，其中=Lane I为纯化蛋白，Lane 2为pGEX+T-l空载体对照。图3为中空多孔硅纳米颗粒(HMSNs)吸附结合蛋白的规律曲线，其中标记圆点的线、标记三角的线及标记菱形的线分别代表吸附浓度为l、5、10mg/mL的HMSNs。图4为HMSNs体外控释蛋白的规律曲线。图5为小鼠血清抗体效价的ELISA检测。图6为T淋巴细胞增值实验。图7为T淋巴细胞亚群，其中图7的上图为⑶4+分布，下图为⑶8+分布。图8为小鼠血清的INF- Y的ELISA检测。具体实施方式I)合成中空多孔硅纳米颗粒(HMSNs)本专利技术中应用的HMSN合成方法如文献Guo H，Qian H，Sun S，Sun D，Yin H， Cai X, Liu Z, Wu J, Jiang T, Liu X. Hollow mesoporous silica nanoparticles for intracellular delivery of fluorescent dye. Chem Cent J. 2011,5(1) :1 中所述。具体步骤如下取14mL无水乙醇和26. 5mL去离子H2O混合，搅拌使其混匀并加入0. 5mLTE0S和 0. 08g CTAB，随后加入0. 5mL 25%的氨水并在室温条件下持续搅拌3h。将混合好的乳浊液 8000 10000rpm/min离心10 15min,弃去上清,用去离子水洗沉淀3次。将沉淀取出置于马弗炉中200°C煅烧6h然后再600°C煅烧6h后得产物粉末。将合成好的粉末状HMSN溶解到0. OlM PBS(pH7. 4)中，以扫描电镜和透视电镜观察其颗粒形态。从电镜图片可见所合成的纳米颗粒为中空球形颗粒，直径大小约为200nm，表面为疏松多孔结构，其结构见图1。2) PCV2GST-0RF2表位蛋白的表达和纯化本专利技术釆用的融合蛋白PCV2GST-0RF2表位蛋白的诱导表达及纯化如文献Sun SQ, Guo HC，Sun DH, Yin SH,Shang YJ, Cai XP, Liu XT. Development and validation of an ELISA using a protein encoded by 0RF2antigenic domain of porcine circovirus type 2. Virol J. 2010，7 :274.中所述，具体方法为将阳性克隆菌以1: 100接种于LB培养基(100 μ g/mL ampicillin),于 37°C摇培(250rpm/min)直至菌液的 0D600nm 值介于 0. 6-0. 8，以IPTG(终浓度0. 1M)诱导表达，37°C摇培3h后收菌，PCV2GST-0RF2融合蛋白应用 MagnetGST Glutathione Particles(Promega)进行纯化。对洗脱得到的 PCV2GST-0RF2 融合蛋白进行SDS-PAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒用于运载猪圆环病毒抗原表位蛋白，这种纳米载体颗粒的直径为100～200nm。
【技术特征摘要】
1.一种具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒用于运载猪圆环病毒抗原表位蛋白，这种纳米载体颗粒的直径为100 200nm。2.权利要求1所述的运载猪圆环病毒抗原表位蛋白的纳米载体在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。3.权利要求1所述的蛋白载体承载猪圆环病毒PCV2GST-ORF2表位蛋白的方法，其特征在于将具有多孔结构的空心球状硅纳米颗粒溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中配制成多孔...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，孙世琪，冯小明，孙德惠，刘湘涛，殷红，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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