本发明专利技术公开了一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法，将编码PCV2核衣壳蛋白的Cap基因连接到pET-28a(+)质粒上构建成表达质粒pET-28-Cap，转化BL21(DE3)感受态细胞，得到基因工程菌种pET-28-Cap/BL21。通过诱导表达及检测表明该重组蛋白具有良好的反应原性。可进一步用来作为诊断抗原或制备亚单位疫苗。产物在大肠杆菌中以可溶性形式表达，表达量大且避免了蛋白变性再复性的繁琐过程，降低了蛋白的损耗和生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪II型圆环病毒0RF2蛋白的制备方法。
技术介绍
猪II型圆环病毒(PCV2)是近年来新发现的动物病毒之一，属于圆环病毒科，是一种二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒，病毒粒子直径为17nm，是目前发现的最小的动物病毒。该病最早于1991年在加拿大西部发现，根据致病性的不同，被分为PCV-1和 PCV-2。其中PCV-2对猪有较强的感染性，可经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪，引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等。感染猪出现进行性消瘦、行动迟缓、呼吸困难、黄疸、 皮肤苍白，甚至死亡，病原学及血清学调查表明，该病在许多国家都广泛存在，给世界养猪业造成了很大的损失。PCV-2基因组含ORFl和0RF2，ORFl编码Rep蛋白，参与病毒复制，0RF2编码233个氨基酸，是病毒的核衣壳蛋白(Cap)，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗和临床检测的首选抗原。大肠杆菌表达系统不仅具有遗传背景清楚，培养操作简单、转导效率高、生长繁殖快、 成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白 质表达系统。另外，诱导剂乳糖是一种二糖，没有毒性，价格低廉，其本身作为一种碳源，可以被菌体代谢利用，乳糖所具备的无毒和价廉的优点，使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中，仍具有优于IPTG的潜在价值和优势。猪II型圆环病毒(PCV2)细胞培养灭活疫苗产量低且国内缺乏对PCV2疫苗统一的生产检验方法及标准，这些问题已成为限制该类产品开发和应用的瓶颈；新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率还有待证实，而国外已有亚单位疫苗上市，能显著降低病毒血症，但价格昂贵。猪II型圆环病毒0RF2蛋白亚单位疫苗中已有关于使用酵母和杆状病毒表达0RF2蛋白的报道，但酵母表达系统繁琐，可能存在蛋白切割的问题，而杆状病毒则存在表达成本高，蛋白纯化困难等缺点。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种降低蛋白的损耗和生产成本的猪II型圆环病毒 0RF2蛋白的制备方法。本专利技术采用如下技术方案包括以下步骤1.序列合成通过序列比对，在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列，把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并在序列两端分别加上EcoR I和Not I限制性酶切位点，合成cap基因，连接到PES载体上，按照设定的限制性内切酶进行酶切，将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态DH5a细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定阳性质粒；2.原核表达载体的构建与鉴定将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切，回收702bp的目的片段，与同样经EcoR I 和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a+连接，连接体系目的片段5uL，pET_28a+载体 3uL，T4 DNA Ligase luL，10*buffer luL，4°C连接过夜；取 ΙΟμ 连接产物与 ΙΟΟμ BL21 感受态细胞混合，冰浴30min，42°C热激90s后迅速置冰浴中静置2min，加入800μ 无抗生素的LB培养基，370C 150 rpm摇床培养45min后，5000rpm离心5min,弃上清，留200uL将菌体吹匀后涂布含kana，100 μ g/mL的LB平板，37°C温箱倒置培养12_16h ;次日挑取白色单菌落，用含kana的LB培养基小量扩增培养；0MEGA试剂盒小量提取质粒；分别经PCR鉴定和EcoR ,Not I双酶切鉴定，将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析；3.重组菌的诱导表达将鉴定为阳性的BL21菌液按1:100的比例转接到含kana的LB液体培养基中，37°C 振荡培养至对数生长期时，0D_值为O. 6，加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、 6h，同时设未诱导菌液对照和pET-28a/BL21诱导对照；取ImL菌液，13000rpm离心Imin 后，弃上清，加入 50uL PBS 和 50uL 2*SDS_PAGE Loading Buffer 重悬，沸水煮 5 min，进行12%SDS-PAGE，结果显示，pET-28-cap在30kDa处有一条很浓的蛋白条带，与预期目的条带大小相符；而未经诱导的重组菌则无此条带，空载体质粒pET-28a+转化菌经诱导后在约 7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带，说明蛋白已经得到了表达；4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化通过对诱导温度，诱导时间，诱导剂浓度等诱导条件的摸索，重组菌在37°C，10g/L乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h ，蛋白的可溶性表达量最大；冻融菌体并进行超声破碎 30min，设置为间隔I秒，超声3秒，离心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白样品进行 12%SDS-PAGE电泳；对可溶性的重组蛋白进行His-蛋白质镍亲和层析。本专利技术猪II型圆环病毒0RF2蛋白的制备方法的有益效果是利用大肠杆菌表达系统， 不断摸索诱导条件，实现了蛋白的可溶性表达，避免了蛋白变性、复性等的繁琐过程，降低了生产成本,适宜于规模化发酵生产。附图说明图1为pET-28-cap重组菌在大肠杆菌中的蛋白表达；图 2 western blot 鉴定图。在图1中，1、2、4、5为诱导的pET-28-cap重组菌；M为低分子量蛋白marker ;3为未诱导的pET-28-cap重组菌；6为空载体pET_28a(+)对照；在图2中，M为低分子量预染蛋白marker ;1为目的蛋白；2为未诱导菌体对照。具体实施方式请参阅图1和图2所示，本专利技术的一种猪II型圆环病毒0RF2蛋白的制备方法，包括以下步骤1.序列合成通过序列比对，在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列，把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并在序列两端分别加上EcoR I和Not I限制性酶切位点，合成cap基因，连接到PES载体上，按照设定的限制性内切酶进行酶切，将目的片段克隆至pMD18-T质粒载体上，转化感受态DH5a细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定阳性质粒。2.原核表达载体的构建与鉴定 将质粒pES-Cap经EcoR I和Not I双酶切，回收702bp的目的片段，与同样经EcoR I 和Not I双酶切的线性表达载体pET-28a(+)连接，连接体系目的片段5uL，pET_28a(+) 载体 3uL，T4 DNA Ligase luL，10*buffer luL，4°C连接过夜。取 ΙΟμ 连接产物与 ΙΟΟμ BL21 (DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，42°C热激90s后迅速置冰浴中静置2min，加入 800μ 无抗生素的LB培养基，37°C 150 rpm摇床培养45min后，5000rpm离心5min，弃上清，留200uL将菌体吹匀后涂布含kana (100 μ g/mL)的LB平板，37°C温箱倒置培养12_16h。 次日挑取白色单菌落，用含kana的LB培养基小量扩增培养。OMEGA试剂盒小量提取质粒。 分别经PCR鉴定和EcoR ,Not I双酶切鉴定，将鉴定阳性的重组质粒命名为pET-28-Cap并进行序列测定分析。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪II型圆环病毒ORF2蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1.序列合成通过序列比对，在保证编码的氨基酸相同的前提下改变核苷酸序列，把序列中的稀有密码子替换成大肠杆菌偏爱密码子，并在序列两端分别加上EcoR?I和Not?I?限制性酶切位点，合成cap基因，连接到PES载体上，按照设定的限制性内切酶进行酶切，将目的片段克隆至pMD18?T质粒载体上，转化感受态DH5a细胞，挑取阳性菌落，OMEGA试剂盒小量提取质粒，酶切鉴定阳性质粒；2．原核表达载体的构建与鉴定将质粒pES?Cap经EcoR?I和Not?I双酶切，回收702bp的目的片段，与同样经EcoR?I和Not?I双酶切的线性表达载体pET?28a(+)连接，连接体系：目的片段5uL，pET?28a(+)?载体3uL，T4?DNA?Ligase?1uL，10*buffer?1uL，4℃连接过夜；取10μL连接产物与100μL?BL21感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s后迅速置冰浴中静置2min，加入800μL无抗生素的LB培养基，37℃?150?rpm摇床培养45min后，5000rpm离心5min，弃上清，留200uL将菌体吹匀后涂布含kana，100μg/mL的LB平板，37℃温箱倒置培养12?16h；次日挑取白色单菌落，用含kana的LB培养基小量扩增培养；OMEGA试剂盒小量提取质粒；分别经PCR鉴定和EcoR??、Not?I双酶切鉴定，将鉴定阳性的重组质粒命名为pET?28?Cap并进行序列测定分析；3.重组菌的诱导表达将鉴定为阳性的BL21菌液按1：100的比例转接到含kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期时，OD600值为0.6，加入不同终浓度的乳糖分别诱导2h、3h、4h、5h、6h，同时设未诱导菌液对照和pET?28a/BL21诱导对照；取1mL菌液，13000rpm离心1min后，弃上清，加入50uL?PBS和50uL?2*SDS?PAGE?Loading?Buffer重悬，沸水煮5?min，进行12%SDS?PAGE，结果显示，pET?28?cap在30kDa处有一条很浓的蛋白条带，与预期目的条带大小相符；而未经诱导的重组菌则无此条带，空载体质粒pET?28a(+)转化菌经诱导后在约7kDa处出现组氨酸标签蛋白条带，说明蛋白已经得到了表达；4.重组菌的可溶性表达及蛋白纯化通过对诱导温度，诱导时间，诱导剂浓度等诱导条件的摸索，重组菌在37℃，10g/L?乳糖浓度等诱导条件下诱导表达6h，蛋白的可溶性表达量最大；冻融菌体并进行超声破碎30min，设置为间隔1秒，超声3秒，离心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白样品进行12%SDS?PAGE电泳；对可溶性的重组蛋白进行His?蛋白质镍亲和层析。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李朝阳，李明义，石乔，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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