本发明专利技术公开了猪捷申病毒DBN‑10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用。本发明专利技术提供的猪捷申病毒DBN‑10021株全基因组序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术的提供用于扩增所述猪捷申病毒DBN‑10021株全基因组序列的引物，其包括序列如SEQ ID No.2~13所示的引物。本发明专利技术将病毒基因组序列分为6个片段，用RT‑PCR方法扩增相应的cDNA，可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等。
【技术实现步骤摘要】
猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及捷申病毒4型全基因组序列测定方法，具体的说是猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列测定方法。
技术介绍
猪捷申病毒（Porcineteschovirus,猪捷申病毒）可引起猪的脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等多种临床表现。捷申病毒基因型众多，目前至少存在11个基因型，并且同一基因型的不同分离株的基因组间也存在较大差异。我国许多研究显示，猪群中猪捷申病毒的阳性率比较高，而在我国仅见有关猪捷申病毒2型和猪捷申病毒8型基因组的研究报道，其主要原因在于猪捷申病毒基因组变异大，不易设计引物，直接影响到猪捷申病毒基因组全长序列的测定。针对上述问题，目前急需一种有效、简单、准确可靠的猪捷申病毒4型全基因组测序方法，并通过该方法得到猪捷申病毒4型的全基因组序列。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供猪捷申病毒（Porcineteschovirus）DBN-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用。本专利技术提供的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供用于扩增猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的引物，其包括序列如SEQIDNo.2~13所示的引物。进一步地，所述的引物还可包括SEQIDNo.14和SEQIDNo.15所示的引物。本专利技术还提供一种测定扩增猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的方法，其包括如下步骤：1）提取猪捷申病毒DBN-10021株RNA，反转录成cDNA；2）用SEQIDNo.2~15所示引物对全基因组序列进行分段PCR扩增，分别为：SEQIDNo.2和14扩增后再用SEQIDNo.3和15嵌套扩增；SEQIDNo.4和5；SEQIDNo.6和7；SEQIDNo.8和9；SEQIDNo.10和11；SEQIDNo.12和13；3）目的片段回收、连接、转化、阳性菌的鉴定、测序；4）利用生物软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，将6个片段首尾相连，得到猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列。其中，所述PCR反应条件参数为：94℃预变性5min，然后94℃30~60s；50℃30~60s；72℃20s-2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。本专利技术提供的用于测定猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的引物可以用于制备猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒，因此本专利技术还提供含有所述引物的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒。所述试剂盒还可含有常规的PCR试剂，如Taq酶，dNTPs等。本专利技术将病毒基因组序列分为6个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA，将扩增片段克隆到T载体进行测序，在扩增中所用的引物是根据猪捷申病毒保守区域的核苷酸序列所设计的，引物3’端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基尽可能避免终止在氨基酸密码子的第三位碱基上。本专利技术可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等。本专利技术的猪捷申病毒DBN-10021株属于猪捷申病毒4型毒株，于2011年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.5573。附图说明图1所示为捷申病毒各亚型进化树。图2所示为扩增片段1~6的琼脂凝胶电泳图片。1~6：表示基因组第1~6段；M1、M2、M3分别表示不同的DNAMarker；N1、N2、N3分别表示阴性对照。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的克隆（1）病毒RNA的提取取猪捷申病毒DBN-10021株（CGMCCNo.5573），经PK15细胞传代，收集第5代细胞毒液，反复冻融3次，然后12000r/min，4℃离心5分钟。取病毒悬液250μl放在1.5mlEP管中，加入0.75mlTranszol（北京全式金生物技术有限公司），混匀；再加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，室温孵育3分钟。12000r/min4℃离心10分钟。离心后转移上层水相到新的1.5mlEP管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10分钟。12000r/min4℃离心10分钟，弃去上清，留沉淀。加入1ml75%乙醇（DEPC处理的水配制），剧烈震荡。12000r/min4℃离心5分钟，弃上清，室温晾干沉淀，后将沉淀用50~100μlRNA溶解液中。（2）病毒RNA的反转录利用TransScriptTMFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）制备cDNA。以提取的病毒RNA为模板进行cDNA的合成，反应体系为：RNA8μl，RandomPrimer1μl，2×TSReactionMix10μl，TransScriptRT/RIEnzymeMix1μl。25℃孵育10min，42℃孵育30min。之后85℃加热5min使TransScriptRT/RIEnzyme失活。（3）引物设计与合成通过对多个猪捷申病毒全基因组序列的比对，选取保守的序列作为引物，引物3’端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基尽可能避免终止在氨基酸密码子的第三位碱基上，相邻的扩增片段之间有长短不等的重叠。共设计12条引物，将病毒的全基因组序列分为6段，具体引物序列及其对应位点如表1所示，SEQIDNo.2和SEQIDNo.3分别为与5’RACE试剂盒配套使用的反向引物，SEQIDNo.14为正向外套引物（试剂盒提供），SEQIDNo.2为反向外套引物，SEQIDNo.15为正向内套引物（试剂盒提供），SEQIDNo.3为反向内套引物；SEQIDNo.4和SEQIDNo.5为正反引物对；SEQIDNo.6和SEQIDNo.7为正反引物对；SEQIDNo.8和SEQIDNo.9为正反引物对；SEQIDNo.10和SEQIDNo.11为正反引物对；SEQIDNo.12和SEQIDNo.13为正反引物对。“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。引物位置以捷申病毒4型PS36株（GenBank登录号：AF296089）的基因组为参考。表1引物信息注：“/”表示此引物序列在捷申病毒序列中的位置不确定。该引物中的15个“T”与捷申病毒3’端的PolyA尾巴相对应，引物中的“CCGGGGGCC”具有稳定该引物的作用，属于额外添加的碱基。（4）基因片段的PCR扩增将全基因组分为6个片段分别扩增，引物如SEQIDNo.2至SEQIDNo.15所示。第1段为基因组的5'末端，设计长度为300bp左右，其余5段扩增长度为1500~2000bp，第2段至第6段依次位于基因组的5'端至3'端。第1段采用Takara5'FμllRACEKit，并利用套式PCR扩增基因组5'序列，其中正向的外套（SEQIDNo.14）、内套引物（SEQIDNo.15）由试剂盒提供，反向的外套、内套引物由自己设计本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪捷申病毒DBN？10021株全基因组序列，其序列如SEQ？ID？No.1所示。
【技术特征摘要】
1.猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，其序列如SEQIDNo.1所示。2.用于扩增权利要求1所述序列的引物，其包括序列如SEQIDNo.2~13所示的引物。3.如权利要求2所示的引物，其特征在于，还包括序列如SEQIDNo.14和SEQIDNo.15所示的引物。4.一种测定权利要求1所述序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）提取猪捷申病毒DBN-10021株RNA，反转录成cDNA；2）用SEQIDNo.2~15所示引物对全基因组序列进行分段PCR扩增，分别为：SEQIDNo.2和14扩增后再分别用SEQIDNo.3和15、SEQIDNo.4和5、SEQIDNo.6和7、SEQIDNo.8和...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫晓文，王美君，张志榜，焦连国，王贵华，赵亚荣，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，福州大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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