本发明专利技术提供了一种利用家蚕生物反应器生产PCV2?Cap蛋白的方法及Cap蛋白制品，包括：克隆PCV2?Cap蛋白的编码基因序列，至重组杆状病毒，使用重组昆虫杆状病毒直接注射感染家蚕幼虫或蚕蛹，回收并分离纯化PCV2?Cap蛋白。本发明专利技术具有操作简单、周期短的特点，避免了病毒同源重组噬斑筛选这一难以操作并成功率低的步骤，极大地缩短了实验周期；操作简单，成本低，后提取方法简单，适合工业化的生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，特别是指一种使用基因工程手段在家蚕中生产制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白及其方法，属于基因工程领域。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属圆环病毒属，是一种二十面对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同，可将PCV分为猪圆环病毒I型(PCVl)和猪圆环病毒2型(PCV2)。其中，PCVl对猪无致病性，PCV2对临床危害很大，它可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemicwastingsyndrome,PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等多种疾病的爆发，给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。研究发现，PCV2含有11个开放 阅读框(Open reading frame,ORF),ORFl和0RF2为最主要的两个阅读框。现已证实0RF2为编码病毒的主要结构蛋白和衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白上存在抗原表达位点，具有免疫原性，是PCV2特异性血清学检测方法和亚单位疫苗、核酸疫苗的基础。普莱柯生物工程股份有限公司的专利技术CN 101920012 A公开了一种家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为载体，通过转移载体中的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因同源重组的方式将猪圆环病毒2型Cap蛋白基因整合至家蚕核型多角体启动子下进行目的蛋白表达，可以获得PCV2 Cap蛋白的大规I旲表达，制备成含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的亚单位疫苗。但该方法需要通过使用BmNPV与AcNPV共转染并通过噬斑筛选的方法，获得含PCV2 Cap蛋白的重组家蚕核型多角体病毒，而BmNPV与AcNPV同源重组的几率低，噬斑筛选存在工作量大、成功率低的缺点；此外，噬斑筛选需要培养家蚕细胞，需要含胎牛血清(FBS)的TC-100培养基，且培养周期较长(一般为7-8天)。因此，该噬斑筛选方法存在工作量大、试验成本高、试验周期长的缺点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，包括以下步骤(I).克隆猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因序列，转入转移载体，获得包含猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组转移载体；(2).将上述重组转移载体转化入含有病毒穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得含有猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；(3).重组昆虫杆状病毒注射感染家蚕幼虫或蚕蛹；(4).回收获重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴；(5).分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。优选地，本专利技术的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(I)中猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码序列包含序列表中的SEQ ID NOl。优选地，本专利技术的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码的基因的表达受多角体启动子的控制。优选地，本专利技术的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的昆虫杆状病毒包括昆虫核型多角体病毒。优选地，本专利技术的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的昆虫细胞包括Sf9细胞。优选地，本专利技术的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(3)中所述的家蚕品种包括欧洲种Luobendihong、Baohuang、Hungary ;中 国种Dazao> Qiansanmian、Datuanyuan> Ankang> Lan 5 ；日本种RillO、Dongfei、Sul6、Sul4、YingHXZ、Haoyue 等。优选地，本专利技术的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白序列包含序列表中的SEQ ID N02。优选地，本专利技术的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白为如下三种多肽的任意一种I)含有序列表中的SEQ ID N02序列的多肽；2)与I)所述多肽至少80%同源的多肽；3) I)和2)所述多肽的免疫原性部分。本专利技术的另一目的在于提供上述方法生产的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。技术效果从本专利技术后续实施例中可以看出，本专利技术至少有以下优点I、操作简单、周期短。含PCV2 Cap蛋白的重组家蚕核型多角体病毒，传统的方法需要通过二种病毒(BmNPV与AcNPV)共转染并通过噬斑筛选的方法选择重组病毒，操作周期长，一个噬斑筛选周期为10天左右，顺利的情况下也要经过几轮噬斑筛选才能得到重组病毒，同时要求实验操作人员具有熟练的噬斑筛选技术。而本专利技术避免了病毒同源重组噬斑筛选这一难以操作并成功率低的步骤，极大地缩短了实验周期。2、利用家蚕幼虫和蚕蛹大规模进行Cap蛋白的分泌表达，成本低。重组病毒通过饲喂桑叶或注射的方式感染特定品种家蚕幼虫或蚕蛹，经一定时间饲养后取血淋巴，每条家香或香蛹平均可获得血淋巴500 μ I左右。该过程仅需对感染家香进行常规饲养，不需其他消耗，因此成本十分低廉；每条家蚕最后所取得的血淋巴量十分可观，若经后期纯化后制苗，每条家蚕的血淋巴可制疫苗10头份；感染病毒的血淋巴先后经高速离心和超速离心后，即可获得纯化后的PCV2 Cap蛋白，整个纯化过程没有化学物质等的参与，而仅仅依靠物理方法，不存在污染变性的可能，且操作简单，成本低；若工业化生产成熟后，每头份疫苗成本可控制在I元以内，而现存疫苗每头份市场价格均在12元左右，进口疫苗价格均在35元左右。3、由于家蚕可采用饲料饲养，因此受季节影响不大。且大规模饲养家蚕可采用饲喂桑叶等方式，家蚕感染率可达到99. 8%以上。整个家蚕饲养及感染周期为I个月左右，后期纯化也仅需几天即可。使用该方法进行PCV2 Cap蛋白的表达，只需进行1-2个周期的常规昆虫细胞培养，时间I周左右。在获得一定量的病毒量后，进行下一步家蚕幼虫或蚕蛹的感染。整个实验过程不存在难度，且在常规实验室即可进行。因此，本专利技术可以利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)直接感染家蚕幼虫和蚕蛹，进行PCV2 Cap目的蛋白表达，可以大规模的生产PCV2 Cap蛋白。附图说明图I为PCV2 0RF2基因扩增图；图2 为 PCV2 Cap 蛋白 SDS-PAGE 电泳图；图3 为 PCV2 Cap 蛋白 Western blot 图。具体实施方式 本专利技术实施例中昆虫细胞使用了 Sf9细胞(Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)卵巢细胞)，购自Invitrogen公司。其他类型的昆虫细胞,如家蚕胚胎细胞,家蚕卵巢细胞(BmN)等，只要可以感染本专利技术的转染病毒，即可使用本专利技术之方法生产猪圆环病毒2型Cap蛋白。本专利技术实施例中使用的家蚕品种为大造(Dazao)，其他的与之相一致的家蚕品种，如所述的家蚕品种包括欧洲种Luobendihong、Baohuang、Hungary ;中国种Qiansanmian、Datuanyuan、Ankang、Lan5 ；日本种Ri 110、Dongf本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1).克隆猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因序列，转入转移载体，获得包含猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组转移载体；(2).将上述重组转移载体转化入含有病毒穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得含有猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；(3).重组昆虫杆状病毒注射感染家蚕幼虫或蚕蛹；(4).回收获重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴；(5).分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，白朝勇，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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