本发明专利技术提出了一种诱导叶柄愈伤组织形成多倍体英国梧桐的方法，是通过秋水仙素诱导叶柄愈伤组织加倍形成多倍体英国梧桐新品种（系），以用于解决英国梧桐的“飞毛”问题。其步骤为：a)英国梧桐优株种子的无菌萌发，b)无菌苗叶柄愈伤组织诱导，c)叶柄愈伤组织的秋水仙素处理，d)处理后愈伤组织的恢复培养，e)愈伤组织分化出苗，f)芽苗分化出根，g)组培植株的移植，h)成活植株后的观察和选择，i)选株的无性扩繁成稳定品种（系）。本发明专利技术的多倍体英国梧桐新品种，有利于产生少种子或无种子的球果，免除了飞毛的产生，减少了城市污染，美化了城市环境。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多倍体英国梧桐品种选育方法，特别是，属于现代农业的树木育种
技术介绍
悬铃木科(Platanaceae)植物仅含悬铃木属I属。在我国引进三个物种栽培，即一球的美国梧桐(/Vaiazw1S occidentalis Linn. )，二球的英国梧桐(Platanusacceri folia (kit.) Willd)和三球的法国梧桐 ipiatanus orientalis Linn.),其中以二球的英国梧桐最多.其树形高大、雄伟端庄、枝叶繁茂、耐修剪、易繁殖、生长快、寿命长、抗 烟尘和空气污染，是优秀的庭院树和行道树种郑万钧.中国树木志.1985:1923-1926;陈有民主编.园林树木学.1990:400-403。但是在武汉4月一 5月份球果干枯炸裂，其种子 上的冠毛随处飞舞，不仅污染环境，且经常吹入人口和人眼，导致人们的皮肤疼痒、咳嗽等不适及眼角膜炎等疾病。为此，解决悬铃木飞毛问题是一个极其困难，又必须解决的问题。解决悬铃木飞毛问题的生物技术途径有两条。一是利用多倍体化后植株结实率明显降低，而四倍体与二倍体杂交形成的三倍体就像无籽西瓜那样完全不结实，从而解决飞毛问题;二是利用花器形成或减数分裂基因的失活去产生无花器或完全不育而不能形成种子的不产生飞毛的突变系，从而解决飞毛问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出，是通过秋水仙素诱导叶柄愈伤组织加倍形成多倍体英国梧桐新品种(系)，以用于解决英国梧桐的“飞毛”问题。本专利技术的技术方案为a.英国梧桐优株种子的无菌萌发；b.无菌苗叶柄愈伤组织诱导；c.叶柄愈伤组织的秋水仙素处理；d.处理后愈伤组织的恢复培养；e.愈伤组织分化出芽苗；f.芽苗分化出根；g.组培植株的移植；h.成活植株的比较观察与选择；1.选株的无性扩繁成稳定品种(系)。本专利技术的具体过程为a.英国梧桐优株种子的无菌萌发选择生长旺盛、无病虫害的优良英国梧桐单株上所结的果球，从中剥取种子为研究材料，种子经过O. 1%升萊处理16min—20min后,用无菌水冲洗三遍。将种子接种在萌发培养基上，每IOOml三角瓶接种15粒种子，在25°C黑暗或15001x光照12hr/d下萌发。接种7天一 15天后种子萌发出苗；所述萌发培养基配方为1/2MS大量元素+MS的有机成分+MS的微量元素+MS的铁盐+0. lmg/L—O. 3mg/L6BA+4% 蔗糖 +0. 75% 琼脂，ρΗ5· 8 ；b.无菌苗叶柄愈伤组织诱导当无菌苗生长3个一5个叶片时，在无菌超净工作台上剪下完整叶片，保留O. 5cm—O.8cm叶柄和叶柄上1/5的叶片。再将剪好的叶片的叶柄直立插入到叶柄愈伤组织诱导培养基中，每IOOml三角瓶接种10个处理的带柄叶片。置于20001X光照10hr/d，25°C条件下培养。15天一25天在叶柄基部出现黄色紧实的圆球形愈伤组织；所述叶柄愈伤组织诱导培养基配方为MS +1. Omg/L 2. Omg/L 6BA +1. Omg/L 2. 5mg/L NAA+ 4% sucrose + 0. 75% agar, pH5.8 ；c.叶柄愈伤组织的秋水仙素处理当叶柄愈伤组织生长到35天一40天时，将带愈伤组织的叶柄取出，在超净工作台上去除叶柄和残留叶片，将愈伤组织置于添加500mg/L 750ml/L秋水仙素，但不加琼脂的叶柄愈伤组织诱导培养基的叶柄愈伤组织加倍培养基中，放在温室(25°C )摇床上，在50转飞O转/分钟的速度下旋转培养48hr 60hr ；所述加倍培养基配方为MS+500mg/L 750mg/L秋水仙素+1. 0mg/L 2. 0mg/L 6BA+1. 0mg/L 2. 5mg/L NAA+4% sucrose , pH5. 8 ； d.处理后愈伤组织的恢复培养叶柄愈伤组织加倍处理完毕，取出愈伤组织经无菌水冲洗三次和无菌滤纸吸干愈伤组织表面水分后，再将其接种到叶柄愈伤组织诱导培养基上，恢复培养7天。e.愈伤组织分化出芽苗经恢复培养的愈伤组织接种到分化培养基中分化培养。15天 20天后愈伤组织呈现绿点，25天 45天后陆续分化出芽苗，并可见丛苗出现；所述分化培养基配方为MS+1. 5mg/L 3. 0mg/L 6BA+3% sucrose+0. 75% agar pH5. 8 ；f.芽苗分化出根当芽苗分化生长到2. Ocm-8. Ocm时，将芽苗靠近愈伤组织处剪断移植于生根培养基中，20天 25天后芽苗基部分化出根而形成完整的组织培养植株；所述生根培养基配方为1/2MS+0. lmg/ L ^l. Omg/ L IBA+2% sucrose+0. 75% agar,pH5.8 ；g.组培植株的移植当组培植株生长到8. 0cnTl2. Ocm高，具有I个 3个根的时候，将进行组培植株的移植。首先将要移植植株的培养瓶盖打开，每瓶添加IOmf 15ml无菌水，放到常温的实验室内缓苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培养基，将植株移栽到灭菌的70%蛭石+15%细砂+15%园土的基质中，浇上1/10MS大量元素溶液，盖上薄膜和黑网(50%遮光率)。然后每2天喷洒1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭开黑网和薄膜，使组培苗健壮生长；h.成活植株的比较观察与选择根据多倍体和二倍体植株外部形态的差异，选取叶片变厚，叶色变浓的植株为初选多倍体株，再取候选多倍体株的叶片表皮细胞观察气孔密度和气孔保卫细胞内的叶绿体数。多倍体植株气孔密度变小，气孔变大，保卫细胞内的叶绿体数目接近二倍体英国梧桐的二倍；再将多倍体叶片和二倍体叶片的细胞核进行细胞流式分析仪的DNA含量测定，多倍体材料叶片中DNA含量相对为二倍体DNA量的二倍。经过形态特征，气孔观察和DNA含量测定都明显显示出多倍体特点的植株确定为多倍体英国梧桐单株(本专利技术所指的多倍体英国梧桐单株是四倍体)。1.选株经无性扩繁成稳定品种(系)由于英国梧桐可以靠枝条茎段繁殖，因此让已确定为多倍体英国梧桐的单株生长到SOcm-1OOcm时截取枝条，按每茎段含3个芽作为繁殖茎段，于立春后的2天-20天内插植于苗床上进行无性扩繁，而成为稳定的多倍体英国梧桐品种(系)。经上述步骤选育的多倍体英国梧桐品种(系)具有几种优良效果1.经过优株上的种子无菌萌发后的无菌苗所取材料不易污染，而且条件易控制，能保证取材的一致性和无菌性操作。2.叶柄愈伤组织诱导频率高，而且能够在培养基中生长，吸收营养快，生长速度快。3.用叶柄愈伤组织进行染色体加倍，诱导效果比整体小苗处理效果好，而且再分化出苗后产生嵌合体的频率低。4.通过对选择多倍体单株的茎段无性扩繁，能较快地形成稳定的多倍体英国梧·桐品种(系)而应用于生产。本专利技术的多倍体英国梧桐新品系，将产生少生种子会不生种子的球果，免除了飞毛的产生，减少了城市污染，美化了城市环境。附图说明图1为本专利技术无菌苗叶柄愈伤组织诱导的带柄叶片图片，图2为本专利技术20天后的圆球形愈伤组织图片，图3为本专利技术愈伤组织分化出芽苗图片，图4为本专利技术芽苗分化出根图片，图5为本专利技术组培植株的移植生长图片，图6为本专利技术多倍体英国梧桐单株移植苗床上图片。具体实验方式下面以实施例一多倍体英桐11号的选育对本专利技术进一步说明a.英国梧桐优株种子的无菌萌发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导叶柄愈伤组织形成多倍体英国梧桐的方法，其特征在于选育过程为：a.英国梧桐优株种子的无菌萌发选择优良英国梧桐单株的种子经过0.1%升汞消毒处理16min—20min后，接种在萌发培养基上，在25℃黑暗或1500lx光照12hr/d下萌发，接种7天—15天后种子萌发出苗；所述萌发培养基配方为：1/2MS大量元素+MS的有机成分+MS的微量元素+MS的铁盐+0.1mg/L—0.3mg/L6BA+4%蔗糖+0.75%琼脂，pH5.8；b.无菌苗叶柄愈伤组织诱导当无菌苗生长3个—5个叶片时，在超净工作台上剪下完整叶片，保留0.5cm—0.8cm叶柄和叶柄上1/5的叶片，再将剪好的叶片的叶柄直立插入到叶柄愈伤组织诱导培养基中，置于20001X光照10hr/d，25℃条件下培养，15天—25天在叶柄基部出现黄色紧实的圆球形愈伤组织；所述诱导培养基配方为MS+1.0?mg/L~2.0mg/L?6BA+1.0?~2.5mg/L?NAA+4%??Sucrose+0.75%琼脂?，pH5.8；c．叶柄愈伤组织的秋水仙素处理当叶柄愈伤组织生长到35天—40天时，将愈伤组织置于添加500mg/L~750ml/L秋水仙素，但不加琼脂的叶柄愈伤组织加倍培养基中，放在温室（25℃）摇床上，在50转~60转/分钟的速度下旋转培养48hr~60hr；所述加倍培养基配方为：MS+500mg/L~750mg/L秋水仙素+1.0mg/L~2.0mg/L?6BA+1.0mg/L~2.5mg/LNAA+4%?Sucrose?，pH5.8；d．处理后愈伤组织的恢复培养叶柄愈伤组织加倍处理完毕，取出愈伤组织经无菌水冲洗和吸干表面水分后，接种到叶柄愈伤组织诱导培养基上，恢复培养7天；e．愈伤组织分化出芽苗经恢复培养的愈伤组织接种到分化培养基中分化培养15天~20天后愈伤组织呈现绿点，25天~45天后陆续分化出芽苗，并可见丛苗出现；所述分化培养基配方为：MS+1.5mg/L~3.0mg/L?6BA+3%?Sucrose+0.75%?agar，?pH5.8；f．芽苗分化出根当芽苗分化生长到2.0cm—8.0cm时，将芽苗靠近愈伤组织处剪断移植于生根培养基中，20天~25天后芽苗基部分化出根而形成完整的组织培养植株；所述生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/?L?~1.0mg/?L?IBA+2%?sucrose+0.75%?agar，pH5.8；g．组培植株的移植当组培植株生长到8.0cm~12.0cm高，具有1个~3个根的时候，将进行组培植株的移植，首先将要移植植株的培养瓶盖打开，每瓶添加10ml~15ml无菌水，放到常温的实验室内缓苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培养基，将植株移栽到灭菌的70%蛭石+15%细砂+15%园土的基质中，浇上1/10MS大量元素溶液，盖上薄膜和黑网，然后每2天喷洒1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭开黑网和薄膜，使组培苗健壮生长；h．成活植株的比较观察与选择根据多倍体和二倍体植株外部形态的差异，选取叶片变厚，叶色变浓的植株为初选多倍体株，再取候选多倍体株的叶片表皮细胞观察气孔密度和气孔保卫细胞内的叶绿体数多倍体植株气孔密度变小，气孔变大，保卫细胞内的叶绿体数目接近二倍体英国梧桐的二倍；再将多倍体叶片和二倍体叶片的细胞核进行细胞流式分析仪的DNA含量测定，多倍体材料叶片中DNA含量相对为二倍体DNA量的二倍；经过形态特征，气孔观察和DNA含量测定都明确显示出多倍体特点的植株确定为多倍体英国梧桐单株；i.选株经无性扩繁成稳定品种、品系将已确定为多倍体英国梧桐的单株生长到80cm?100cm时截取枝条，按每茎段含3个芽作为繁殖茎段，于立春后的2天?20天内插植于苗床上进行无性扩繁，而成为稳定的多倍体英国梧桐品种（系）。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡得田，陈冬玲，王维，宋兆建，何玉池，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
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