一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法技术

本发明专利技术提供一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，涉及生物技术领域，以解决现有方法很难得到纯合四倍体的问题。一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，包括如下步骤：启动培养，诱导培养，伸长培养，壮苗培育，幼叶检测。本发明专利技术用以培养得到酸枣纯合四倍体材料，为枣树遗传改良提供支持。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供，涉及生物
，以解决现有方法很难得到纯合四倍体的问题。，包括如下步骤：启动培养，诱导培养，伸长培养，壮苗培育，幼叶检测。本专利技术用以培养得到酸枣纯合四倍体材料，为枣树遗传改良提供支持。【专利说明】
本专利技术涉及生物
，特别是指。
技术介绍
麥（Zizyphus. jujuba Mill.)为鼠李科（Rhamnaceae)麥属（Zizyphus. Mill.)植 物，是原产于中国的特色优势经济树种，其味道鲜美，果形美观，富含人体所需的多种氨基 酸和维生素，还含有多种多糖、微量元素及抗癌物质环磷酸腺苷等药用成分，是药食两用滋 补品。 酸麥（Ziziphus spinosus Hu.)原产中国华北，多野生，耐干旱、贫瘠，在山区开发 中曾发挥重要作用。酸枣花期长，是良好的蜜源植物，种仁饱满可入药。酸枣作为食品，营养 价值很高，含有钾、钠、铁、锌、磷、硒等多种微量元素；更重要的是酸枣中含有大量的维生素 C，其含量是普通红枣的2?3倍、柑橘的20?30倍，在人体中利用率可达86. 3%。此外， 近年来果汁、果醋等天然养生食品深受广大消费者喜爱，酸枣作为生产原材料，其枣果品质 的增加可以大幅提商生广效率，减少生广成本。 酸枣的多倍体研究已有一些报道，但多采用田间愈伤组织途径或材料为丛芽、茎 段的离体诱导途径，这些途径通常会形成的嵌合体，很难得到纯合四倍体。本专利技术以酸枣无 菌苗的幼嫩叶片作为试验材料，采用直接再生不定芽途径进行多倍体的诱导，从而有效的 避免嵌合体的出现。此外，对于枣树叶片离体多倍体诱导最佳处理时期的相关研究还未见 报道，本专利技术采用两步培养法，在第一步预（暗）培养中首次找到秋水仙碱最佳处理时期， 进而可以提高诱变效率，以期短时间内获得大量的多倍体材料，对枣树的遗传改良具有重 要价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供酸枣不定芽途径诱导多倍体中秋水仙碱的最佳 处理时期、适宜浓度和处理时间，以解决现有方法很难得到纯合四倍体的问题。 为解决上述技术问题，本专利技术实施例提供一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方 法，包括如下步骤：启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种到不定芽启动培养 基一上进行9?1 Id预（暗）培养；诱导培养，将叶片转至含有40?80mg/L秋水仙碱的液 体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下lOOrmp摇床震荡培养2?3d后转入不定 芽启动培养基一上继续暗培养8?10d ;伸长培养，预（暗）培养结束后，将叶片转接到不 定芽伸长培养基二上，移至光下培养25?35d ;壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上 剥离，转接到含有植物生长调节剂的MS壮苗培养基中，培养18?20d ;幼叶检测，待不定芽 生长健壮后，取幼嫩叶片，进行多倍体检测。 其中，所述不定芽启动培养基一包括改良WPM基本培养基和包含1. Omg/L的噻苯 隆和0. 3mg/L的吲哚-3- 丁酸的植物生长调节剂；所述不定芽伸长培养基二包括改良WPM 基本培养基和包含0. lmg/L的吲哚-3-乙酸和0. 5mg/L的赤霉素的植物生长调节剂。 其中，所述改良WPM基本培养基含蔗糖30g/L，ph = 5. 8?6. 2,配方为： 【权利要求】1. ，其特征在于，包括如下步骤： 启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种到不定芽启动培养基一上进行 9?lid预（暗）培养； 诱导培养，将叶片转至含有40?80mg/L秋水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培 养，在黑暗条件下lOOrmp摇床震荡培养2?3d后转入不定芽启动培养基一上继续暗培养 8 ?10d ; 伸长培养，预（暗）培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上，移至光下培养 25 ?35d ; 壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上剥离，转接到含有植物生长调节剂的MS壮 苗培养基中，培养18?20d; 幼叶检测，待不定芽生长健壮后，取幼嫩叶片，进行多倍体检测。2. 根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述不 定芽启动培养基一包括改良WPM基本培养基和包含1. Omg/L的噻苯隆和0. 3mg/L的吲 哚-3- 丁酸的植物生长调节剂； 所述不定芽伸长培养基二包括改良WPM基本培养基和包含0. lmg/L的吲哚-3-乙酸和 0. 5mg/L的赤霉素的植物生长调节剂。3. 根据权利要求2所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述改良 WPM基本培养基含蔗糖30g/L，ph = 5. 8?6. 2,配方为：4.根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述MS壮 苗培养基含蔗糖30g/L，ph = 5. 8-6. 2,配方为：5. 根据权利要求4所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述MS壮 苗培养基中的植物生长调节剂为1. Omg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0. 4mg/L的吲哚丁酸。6. 根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述幼嫩 叶片为酸枣无菌苗植株形态学上端至下端的第3-5枚的三枚叶片；所述叶片刻伤方法为沿 中脉垂直方向横切2?3个伤口，切断主脉但不切断叶片；所述接种方式为近轴端接触培养 基。7. 根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述诱导 培养所用液体培养基为不加入琼脂的不定芽启动培养基一，所述秋水仙碱的浓度为40? 80mg/L。8. 根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述伸 长培养阶段采用人工控制的培养条件，所述人工控制的培养条件中光照强度为19000x? 21002x，光照时间12?16h/d，温度23?27°C。9. 根据权利要求1所述的酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，所述多倍 体检测方法为流式细胞仪法，所用裂解液为改良WPB裂解液，所用染液为10ug/L的DAPI染 液； 其中，所述改良1?8裂解液？11 = 7.2?7.8，配方为： 改良WPB裂解液成分|配置1L含量 Tris · HC1 24.22g MgCl2 · 6H20 0. 81g Na2EDTA · 2H20 0. 74g【文档编号】A01H4/00GK104082146SQ201410334141【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日 【专利技术者】李颖岳, 王岩, 庞晓明, 王欢, 康亚璇 申请人:北京林业大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酸枣不定芽途径诱导多倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：启动培养，剪取酸枣无菌苗的幼嫩叶片，刻伤后接种到不定芽启动培养基一上进行9～11d预(暗)培养；诱导培养，将叶片转至含有40～80mg/L秋水仙碱的液体培养基中进行多倍体诱导培养，在黑暗条件下100rmp摇床震荡培养2～3d后转入不定芽启动培养基一上继续暗培养8～10d；伸长培养，预(暗)培养结束后，将叶片转接到不定芽伸长培养基二上，移至光下培养25～35d；壮苗培育，将叶片再生出的不定芽从叶片上剥离，转接到含有植物生长调节剂的MS壮苗培养基中，培养18～20d；幼叶检测，待不定芽生长健壮后，取幼嫩叶片，进行多倍体检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李颖岳，王岩，庞晓明，王欢，康亚璇，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11