本发明专利技术公开了多残留金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用，属于免疫学领域。本发明专利技术试剂盒主要包括多残留金标快速检测卡，所述检测卡包括检测条和塑料卡壳，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成；所述金标结合垫是由胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体、胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体和胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体组成；所述硝酸纤维素膜中部包被有检测线和控制线，检测线设置蛋白偶联物，控制线是羊抗鼠IgG单克隆抗体。本发明专利技术为快速检测试剂盒，仅需通过简单的前处理就能实现多种残留物质的同时检测，整个操作过程简单、携带方便、结果判定快速、准确，适用于现场监控和大量样本的定性筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学领域，涉及快速检测食品中氨基糖苷类抗生素庆大霉素残留的试剂盒和方法。
技术介绍
自2008年以来，乳制品的安全问题在全国乃至全世界造成了巨大的影响，不仅广大消费者的权益受到了损害，整个乳制品行业包括众多的奶农的利益也受到了巨大损害。 乳制品行业的食品安全问题已经严重关系到了我国的国计民生，急需解决。乳制品的安全， 既需要从源头开始，通过各项规章制度对质量进行层层控制，也需要各种检测技术进行层层把关。由于乳制品生产涉及的原料数量巨大、来源众多，因此如何实现对大量原料奶样品准确快速的筛选，是目前检测技术急需突破的难点之一。另一方面，因抗生素种类的增多以及细菌耐药性的增强，目前用于奶牛疾病预防和治疗中的药物种类也大大增多，使得原料奶中的药物残留除了常见的β_内酰胺类抗生素外，氟喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素的残留比例也大大增加。这些药物残留对人体同样存在着安全隐患，如氟喹诺酮类药物在人体内的残留易引起人体神经系统不良反应， 严重时还会诱发癫痫病，并伴有潜在的催畸作用，氨基糖苷类药物则均具有耳毒性和肾脏毒性，能损害脑神经、耳蜗神经，轻者听力下降，重者永久性耳聋，会对近端肾曲管有损害， 造成血尿、肾功能衰退等，此外，这些药物的长期服用还易引起细菌耐药性。因此，在原奶收购环节，急需一种可以快速检测多种抗生素残留的方法以帮助检验机构和企业节约时间、 降低成本、提高效率。目前，针对氟喹诺酮和氨基糖苷类抗生素的检测方法多是酶联免疫吸附反应 (ELISA)、高效液相色谱(HPLC)或液质联用(LC-MS/MS)等方法。这些方法作为一种实验室常规方法具有准确、灵敏度高、重复性好等特点，然而，由于存在对设备、环境、操作技能等要求，检测周期较长、价格昂贵，因而其检测主要集中在大型科研检测机构或大型企业实验室里，不适合中小企业和众多奶站的大规模样本筛选使用。在快速检测方面，现有的快速检测方法主要集中β -内酰胺类抗生素检测上，比如UNISENS0R、β -STAR、ROSA、SNAP等，而针对氟喹诺酮和氨基糖苷类抗生素的快速检测产品则几乎没有，并且这些方法均是仅针对一种抗生素进行检测，由于牛奶抗生素检测指标较多，单个检测指标的方法则意味着一个原奶样本就需要使用多个检测产品进行多次检测，既耗费了时间，也浪费了人力、财力。因此急需开发多指标快速检测方法以满足日益增加的检测需求。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种能够同时检测食品中多种抗生素残留检测试剂盒及其检测方法和应用；专利技术主要目的在于克服传统的检测方法繁琐，检测耗时长，在实际工作中应用局限性大等缺陷，同时改变了单一项目检测和多种检测项目简单的合并检测的局面，从而提供一种更加快速、简捷、性价比高、安全的检测试剂盒及其检测方法。食品中多残留金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括检测条和塑料卡壳，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。所述金标抗体结合垫是由胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体、胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体和胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体组成；所述硝酸纤维素膜中部包被有检测线和控制线，检测线设置有能与金标抗体结合垫上三种单克隆抗体进行特异性结合的蛋白偶联物，蛋白偶联物分别为环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物，控制线设置有羊抗鼠 IgG单克隆抗体。所述金标抗体结合垫上的胶体金标记庆大霉素单克隆抗体由庆大霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合在一起；胶体金标记卡那霉素单克隆抗体由卡那霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合在一起；胶体金标记氟喹诺酮类单克隆抗体由氟喹诺酮类单克隆抗体与60nm的胶体金颗粒结合在一起。所述硝酸纤维素膜上检测线的环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物的包被浓度分别为O. 08,0. 13和O. 15mg/mL，包被量均为I μ L/cm ；控制线上包被羊抗鼠IgG单克隆抗体，浓度为lmg/mL，包被量为I μ L/cm。一种多残留金标快速检测试剂盒的制备方法阐述如下I)金标抗体结合垫的制备a.空白胶体金的制备采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，通过调节氯金酸和柠檬酸三钠加入量制备胶体金颗粒大小为25nm和60nm的胶体金溶液。炼制过程中溶液的颜色会发生变化，当溶液的颜色不再发生变化时保持沸腾状态IOmin后将烧瓶置于室温，充分冷却后，取出反应用的转子，胶体金溶液4°C冷藏保存，保质期为I个月；b.金标抗体重悬液的配制第一步用分析天平称取Tris O. 605g,加入IL烧杯中。第二步用分析天平称取蔗糖25. OOOg,加入以上烧杯中。第三步500mL量筒量取纯水500mL，加入上述烧杯中，使其充分溶解。第四步于磁力搅拌器上温和搅拌，使各组份充分溶解、混匀。第五步将上述液体用4mol HCl调节pH值至8. 2±0.1。第六步用分析天平称取牛血清白蛋白(BSA) 5. 000g，加入以上烧杯中第七步再次于磁力搅拌器上温和搅拌，使BSA充分溶解、混匀。第八步将上述液体用O. 22 μ m微孔滤膜无菌过滤，过滤后的液体装入500mL试剂瓶中，贴签，4 °C备用，保存有效期2个月。c.胶体金标记抗体的制备分别取金颗粒大小为25nm或60nm的胶体金溶液IOOmL,在搅拌状态下加入0.1M 碳酸钾150 200 μ L,保持7 10分钟后,缓慢加入相应单克隆抗体进行抗体的金标记， 继续搅拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之终浓度达到0. 4%，持续搅拌30min，最后离心，吸除上清，用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充分重悬；整个反应温度控制室温。庆大霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒溶液进行标记，标记量为3 μ g/mL ；卡那霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒溶液进行，标记量为3 μ g/mL ;氟喹诺酮类单克隆抗体使用60nm的胶体金颗粒溶液进行标记,标记量为5 μ g/mL。d.金标抗体结合垫的制备将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为lcm*30cm的玻璃纤维素膜上， 包被量为2mL/30cm，37°C干燥过夜，密封避光干燥处保存；2)硝酸纤维素膜上T、C线的包被a.庆大霉素-蛋白偶联物的制备称取40mg庆大霉素硫酸盐和IOmgBSA,分别溶解于ImL的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到庆大霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2h以上。取120mgEDC -HCl溶于 ImL蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌Ih以上，然后于4°C放置过夜。 用PBS透析3天后，分装，-20°C贮存。b.卡那霉素-蛋白偶联物制备称取卡那霉素硫酸盐28mg和BSA14mg分别溶于500 μ L蒸懼水中，混合后于磁力搅拌器上搅拌。取76mgEDC. HCl溶于ImL蒸馏水中，再逐滴加入到上述混合溶液中，在室温下搅拌过夜。用O. OlMPBS透析3次以上，离心分装，-20°C贮存。c.环丙沙星-蛋白偶联物的制备称取20mg环丙沙星盐酸盐、IOmgNHS和12. 5mg EDC · HCl充分溶解于ImL 二甲基甲酰胺(DMF)中，于室温下搅拌24h，得到环丙沙星(CPLX)反应液。再称取BSA 50mg，使之充分溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多残留金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括检测条和塑料卡壳，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成；其特征在于所述金标抗体结合垫是由胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体、胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体和胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体组成；所述硝酸纤维素膜中部包被有检测线和控制线，检测线设置有能与金标抗体结合垫上三种单克隆抗体进行特异性结合的蛋白偶联物，蛋白偶联物分别为环丙沙星?BSA偶联物、庆大霉素?BSA偶联物、卡那霉素?BSA偶联物，控制线设置有羊抗鼠IgG单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐慧林，何艳玲，于重楠，刘敏，王丽丽，王丽哲，赵瑜，
申请(专利权)人：北京陆桥技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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