本发明专利技术公开了一种模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，该方法通过选用斑马鱼作为模型动物，通过优化的实验分组方法进行实验分组设计，采用优选的药物给药方式进行给药，采用优选的方法对斑马鱼骨骼进行茜素红染色，采用直观的显微观察捕捉图像，并采用优选的图像分析软件分析骨骼染色区域以反应骨矿化量，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在斑马鱼体内对骨量生成的影响，能快速、准确评价化合物及复杂中药成分防治骨质疏松的作用。能克服一般体外细胞实验难条件苛刻，难以体现在体效应综合结果的缺点，并克服哺乳动物体内实验耗时长，受试药量大、劳动强度高等缺点。该方法实验结果准确度高，且实验方法可重复性强，所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种模式生物评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法。
技术介绍
活性筛选一直是药物发现的关键环节，也是中药物质基础、作用机理、质量控制、 炮制机理、配伍规律等关键领域的不可或缺手段，活性筛选新模型、新方法的研究是中药研究的重要组成部分。骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一类疾病，由于西药长期应用副作用大等缺陷，中药治疗骨质疏松的功效正日益受到重视。 但壮骨中药及其成分特别是微量成分的活性评价却不能高效进行，主要存在2个瓶颈问题一是评价模型问题现有动物壮骨模型耗时长，用样量大，劳动强度大，使得活性筛选效率低；现有细胞模型成本高，试验条件要求较高，原代培养难度增加，一般的实验室不能进行，此外，体外细胞模型作用环节相对单一，不能体现在体试验的综合效果；二是化合物的数量问题由于中药成分复杂，很难分离到能满足体内研究的足量化合物，大量的微量成分只能通过细胞模型进行筛选。可见，现有模型难以实现对中药及其成分壮骨活性的高效、 灵敏、高通量的筛选。模式生物是指在人们研究生命现象过程中长期、反复作为研究材料的物种，从这个物种研究中得出的许多生命活动规律往往代表了许多物种共同的规律。其中斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模饲养繁殖。成体鱼长3 4cm，养殖成本仅为养小鼠的O. 1%_1%。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100%，所以可用斑马鱼模拟人类疾病。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病。如中国专利 200810019040. 5 公开了一种用斑马鱼研究药物毒性的方法，CN101810866A公开了一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的方法，200310108710. 8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病，201010258459. 3公开了一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法。斑马鱼与哺乳动物骨骼生长发育的分子机理极为相似，而且近年来越来越多的调节哺乳动物骨骼发育关键基因的同源基因在斑马鱼基因组中被发现。和哺乳动物一样，斑马鱼的骨骼是从三种胚胎干细胞系发育而来，已有研究表明斑马鱼幼鱼骨包含骨形成和骨吸收活动所需的细胞，是较完整体系。骨骼形成机制也包括软骨内骨化和膜内骨化，其过程都受到包括一系列转录因子和激素在内的复杂机制的严格调控，参与调控的关键基因，如runx2, osteonectin, osteoprogenin等与哺乳动物的相关基因具有高度的同源性。哺乳动物与斑马鱼头部骨骼生成所涉及到的转录因子具有极其相似的表达机制和调控方式。斑马鱼具有与哺乳动物相似的调节骨骼发育的关键基因，具有与哺乳动物相似的骨骼形成机制，以及与哺乳动物相似的系统、酶系及基因，为研究人类许多常见疾病的发病机制提供了理想的实验模型，同时也为药物的作用机制、安全性评价及代谢研究提供了理想的实验模型。因此可将它作为具有完整骨骼体系的理想模式生物用于药物对骨骼的作用研究。国内在这方面的研究尚属空白。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方便、成本低、化合物用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的模式生物斑马鱼模型来快速评价防治骨质疏松的药物作用效果。本专利技术的思路为利用茜素红作为染色剂给斑马鱼加以染色并可反映出机体内骨矿化量和骨密度的机理为茜素红与钙离子形成螯合物，使矿化的骨基质染成红色；再用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行检验；从而可以利用本方法来观察和评估防治骨质疏松药物作用的效果。技术方案为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为本专利技术这种用模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，它包括以下步骤步骤一斑马鱼受精卵的收集控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14-12小时10-12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基(5mM NaCl, O. 17mM KCl, O. 33mM CaCl2, O. 33mM MgSO4, 10_5%亚甲基蓝)。置于恒温培养箱中培养，温度26° C_30° C。步骤二 给药方案方案一取受精后3天(3 dpf)斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基O. 1-2 mL，每个孔里放1-10条幼鱼，分为数组，每组5_15条幼鱼，溶媒阴性对照组和测试药物组。从4 dpf或5 dpf开始加入溶媒和测试药物，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，每个药物浓度做2或3份，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26° C-30° C恒温培养箱中培养。培养周期5-7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后 9-11天或者10-12天。方案二 取受精后3天(3 dpf)斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，加入培养基O. l_2mL，根据培养板孔的大小每个孔里放1-10条幼鱼，分为数组，每组5-15条鱼， 溶媒阴性对照组、模型药物组(泼尼松龙或地塞米松)和测试药物组。造模药和溶媒从4 dpf或5 dpf开始加入,测试药可与模型药同时在4 dpf或者5 dpf加入,也可在模型药物加入48小时后加入，加药方法同“方案一”，即吸净培养孔板里的培养基后迅速加入溶液， 每个药物浓度做2或3份，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入 26° C-30° C恒温培养箱中培养。培养周期5-7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9-11天或者10-12天。步骤三斑马鱼骨骼茜素红染色将培养至受精后9-11天或者10-12天的斑马鱼幼鱼用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)处死，然后将幼鱼固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2-3 h。将固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于50% 乙醇中10 min，去除乙醇，加入用O. 5%K0H配制的茜素红染色液，放置过夜，去除染色液，加入超纯水洗去多余的染液后加入新鲜配制的漂白剂(1.5%H202和1%K0H)，放置20 min-2 h， 去除漂白剂后，加入3:1的O. 5%K0H和甘油的混合溶液30 min-8 h，然后更换溶液为I: I的0.5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后更换溶液为1:3的O. 5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h,最后保存于纯甘油中。步骤四斑马鱼骨骼染色的检测与分析用倒置显微镜观察步骤三中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像(放大100倍)，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置。用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度(IOD)，以分别反应骨矿化量和骨密度。计算平均值，标准偏差，并进行t检验。作为优选方案，以上所述的模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用的新方法，其中步骤二中的溶媒阴性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，利用茜素红可特异性地与钙离子螯合从而使矿化的骨基质染成红色的特性，其特征在于运用模式生物斑马鱼为评价模型，在给予斑马鱼幼鱼防治骨质疏松药物后，通过对其骨骼进行茜素红染色后的图像进行采集和分析，计算出染色区域的面积和累积光密度，即反映骨矿化量和骨密度的数据，以此作为对药物作用效果的评价指标；具体包括以下步骤：步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14?12小时：10?12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26°C?30°C恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后3天斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基0.1?2mL，每个孔里放1?10条幼鱼，分为数组，每组5?15条鱼，溶媒阴性对照组和测试药物组，从受精后4天或受精后5天开始加入溶媒和测试药物，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26°C?30°C恒温培养箱中培养，培养周期5?7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9?11天或者10?12天；步骤三：斑马鱼骨骼茜素红染色：将培养至斑马鱼胚胎受精后9?11天或者10?12天的幼鱼用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐处死，然后将幼鱼固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2?3h，将固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于50%乙醇中10min，去除乙醇，加入用0.5%KOH配制的茜素红染色液，放置过夜，去除染色液，加入超纯水洗去多余的染液后加入新鲜配制的漂白剂，放置20min?2h，去除漂白剂后，加入3:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液30min?8h，然后更换溶液为1:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液6h?24h，最后更换溶液为1:3的0.5%KOH和甘油的混合溶液6h?24h，最后保存于纯甘油中；步骤四：斑马鱼骨骼染色的检测与分析：用倒置显微镜观察步骤三中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置，用专业图像 分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行t?检验。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韦英杰，贾晓斌，王长梅，蔡雪婷，詹扬，孙娥，舒娈，宋捷，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：
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