一株灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产漆酶和β-葡聚糖的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，提供了一株高产漆酶的灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产β-葡聚糖和漆酶的方法。本发明专利技术所涉及的生产菌株为灰树花（Grifolafrondosa），中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC?No.1709。利用该菌株通过液体发酵、固液分离、超滤浓缩、干燥等步骤生产漆酶，同时，以发酵菌丝体为原料经热水提取、冷碱提取、热碱提取、中和、离心、超滤脱盐浓缩、干燥等过程生产β-葡聚糖。该菌株发酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌丝体中β-葡聚糖含量高，达到漆酶与灰树花水溶性β-葡聚糖联产，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一株高产漆酶和β-葡聚糖的菌株，特别涉及一种漆酶与灰树花β-葡聚糖联产的菌株和生产方法。
技术介绍
灰树花(Grifola frondosa)又名贝叶多孔菌，俗称栗子蘑，在分类学上属于担子菌亚门、多孔菌科、多孔菌属。长期以来人们对灰树花进行的大量研究主要集中在多糖方面，而对其产酶特性的研究极少。1883年，日本学者吉田首次从日本紫胶漆树漆液中发现一种可催化漆固化过程的蛋白质。1894年，Bertrand将这种蛋白质命名为漆酶(Laccase)。漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的作用底物，不仅能氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质的毒性，还可以使多种染料脱色及去除有机废水的毒性。近年来在造纸、环保、食品等领域有了广泛的应用。我国最早研究漆酶的是刘国智、黄葆同等，他们于20世纪50年代末利用漆酶在催化反应中需要消耗氧气的特性，设计了漆酶酶活的测定方法。但直到20世纪80年代末，国内对漆酶的研究一直停留在漆酶酶活的测定、漆酶表观特性的描述性研究上。专利CN201010289892. 3公开了一种利用密孔菌属菌株以豆柏(或硝酸钠)为氮源、以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶的方法；专利CN200810198678. X公开了一种产漆酶的灵芝菌株，该灵芝菌是韦伯灵芝TZCl (Ganodermaweberianum TZC1),它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 2648 ;赵玉良等报道了一种利用灰树花发酵制备漆酶的方法，其所用菌株购自上海食用菌研究所，为灰树花子实体栽培菌株，液体培养采用葡萄糖天冬酰胺培养基，260C下，摇瓶液体培养10天，发酵液中的酶活达到最高值，期间采用I. 5%浓度的木质素进行产酶诱导。所产漆酶采用30%的硫酸铵沉淀回收。上述漆酶制备方法中，仅仅是利用灰树花菌株发酵制备漆酶，通过硫酸铵沉淀获得粗酶，未涉及如何利用灰树花发酵菌丝体，由于发酵的目标产物和发酵时间不同，使得菌丝体内的多糖构成和多糖的含量均与现有的不同。以葡聚糖为目标产品时，发酵周期仅为48-96h，而以漆酶为目标产物时，发酵周期长达196-240h,此时菌丝体老化，或者易发生自溶而消亡，或者多糖开始变化，水溶多糖减少，有生物活性的β_葡聚糖大量损失。菌丝体一般被当做废弃物低价出售，不及时处理时，会因腐烂造成环境污染。另外，在漆酶的分离过程中，使用了高浓度的硫酸铵作为沉淀剂，分离漆酶之后的发酵液成为高浓度含盐废水，虽然含有大量的N元素，但由于含S元素过高，不能直接作为肥料使用，需耗费大量资金进行处理才能够达标排放。且以硫酸铵作为沉淀剂，实际上是实验室中作为分离蛋白质的常用方法，不适于工业化应用。因此该方法无法应用于实际生产中，缺乏使用价值。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术存在的不足，提供一株的灰树花菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo. 1709，该菌株可以用于生产漆酶。专利技术人发现其发酵菌丝体中含有大量β_葡聚糖，故该菌株可用于β_葡聚糖的生产。 此外，专利技术人还发现经过适当调整后在灰树花的发酵液中，含有大量漆酶活性的蛋白，因此可利用该菌株作为漆酶的产生菌。利用该菌株发酵生产漆酶，发酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌丝体中β -葡聚糖含量高，达到漆酶与灰树花水溶性β -葡聚糖联产，适合工业化生产。本专利技术首先获得了一株灰树花菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 1709，专利技术人进一步发现通过调整发酵工艺，该菌株既可产生漆酶，又可产生葡聚糖。该菌株可以应用于常规生产，特别是可以应用于漆酶及灰树花葡聚糖的生产，该生产过程主要包括灰树花液体发酵、固液分离、漆酶分离提取、β -葡聚糖分离提取等步骤。在灰树花的发酵过程中应用了漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序。所述的漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序具体步骤如下Α.诱导因子筛选从漆酶可以作用的底物、菌株发酵过程所需的生长因子、酶系的调控三个方面筛选诱导因子，诱导因子选自含特定金属离子的盐或灰树花生长因子或漆酶底物；B.诱导因子使用方法含特定金属离子的盐、特定生长因子及漆酶底物添加入培养基中用于调控菌丝体细胞内酶系；C.发酵控制首先用普通浓度的碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加碳源、氮源，并始终使碳源浓度维持在相对较低但较稳定的浓度水平上，通过不断补料把菌体维持在生长状态，从而提闻漆酶的广率。其中所述诱导因子中的特定金属离子选自含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或锰离子中的一种或几种盐的混合物；生长因子选自B族维生素；底物选自愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等中的一种或几种混合物。之所以选择上述的物质作为诱导因子，主要是由于漆酶是含铜离子的酶系，它的底物主要是愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等富含木素等物质，专利技术人经过研究后发现针对本专利技术所述的菌株而言，要使其产生漆酶，诱导调控的方法主要通过三种方式1、添加底物，如愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等富含木素等物质；2、补充生物生长必须的营养因子，如B族维生素等；3、补充菌体中各种酶系的辅酶离子，主要选择自特定金属离子，一般可以采用其可溶性金属盐的形式，专利技术人发现通过上述三种方式的诱导，结合对于发酵过程的碳源和氮源浓度调整及参数条件控制，可以实现胶漆酶产量的提高。在灰树花产酶发酵的过程中，首先用正常浓度的碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加碳、氮源，并始终使碳源浓度维持在相对较低但较稳定的浓度水平上，通过不断补料把菌体维持在生长状态，从而提闻漆酶的广率。整个生产工艺的具体生产步骤如下CN 102972213 A书明说3/9页(I)灰树花液体发酵A.斜面菌种活化；B.液体摇瓶种子制备；C.诱导产酶的液体发酵培养基制备；D.发酵菌种活化后，经液体发酵扩繁种子菌悬液，再利用液体深层发酵方法生产得到发酵液；发酵的具体过程为，将液体种子以2-10% (v/v)的接种量接到液体发酵培养基中， 初始还原糖浓度为18. 26mg/mL，26°C培养72h，流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w) 的氮源，控制发酵液还原糖在O. 5-2mg/mL水平,氨基氮在100_500mg/L之间，同时控制代谢过程的pH在5. 0-6. 5之间，共培养120-240h ;经上述工艺发酵后，漆酶发酵水平达到500U/ HlL以上；在上述液体发酵培养基制备时，除培养基正常组成成分外，专利技术人还加入上述的产酶诱导因子，如一定量含特定金属离子的盐，可以是含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或锰离子中的一种或几种盐的混合物；或者加入漆酶的底物，如愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等中的一种或几种混合物；或者在培养基灭菌后加入B族维生素的一种或几种；上述诱导因子的加入，再加上流加碳源物质和氮源物质控制还原糖和氨基氮水平， 两个作用积累，使漆酶发酵水平较现有技术提高了 5-10倍。上述发酵过程中，液体发酵培养基中加入的产酶诱导剂中，所筛选出的金属离子对β -葡聚糖的产量影响不大，而加入专利技术人筛选出的漆酶底物虽然会稍微延长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株灰树花菌株，保藏号为CGMCC?No.1709，其用于生产漆酶的用途。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：栾波，徐泽平，高洪奎，刘辛，王丽霞，
申请(专利权)人：黄河三角洲京博化工研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：