本发明专利技术涉及具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。本发明专利技术通过分析存在于自然的微生物区系中的未知的宏基因组，来提供新颖的微生物及蛋白质。本发明专利技术涉及具有序列目录第二序列中所记载的氨基酸序列的海藻酸裂解酶(alginate?lyase)及AlyDW。根据本发明专利技术，提供通过分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的微生物来稳定地分解海藻类的酶。并且，本发明专利技术提供应用从生物工程方面大量生产功能性多糖类的技术来减少在加工工序中派生的废弃物的量，并提高资源的应用度的技术。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AIyDW
本专利技术涉及具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW(MetagenomeLibraries with Alginate Lyase Activity and Novel Enzyme AlyDff)。
技术介绍
海藻类作为在韩国沿近海大量栖息的生物，是一种潜在资源。大部分的海藻类经过简单加工之后可供食用，但是，将来有望成为用作生物能源或者功能性食品及医药原料的资源。 海藻类的组成成分大部分是多糖类，但是盐分含量较高，表层被粘液性的多糖体所包裹。因此，为了利用海藻类作为资源，首先应当伴随多糖体的分解。纤维素和琼脂等多糖体作为￠-1,4-配糖(glycoside),能够被多种微生物分解。但是,利用陆地植物体的多糖体作为基质的微生物和利用海藻类的多糖体作为基质的微生物在栖息环境或基质的氯度方面互不相同。例如，在对黄褐盒管藻的细胞壁分解能力优秀的细菌进行几次继代培养的情况下，能够确认细胞壁分解能力显著下降。为了解决这种问题，需要确立分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的多种微生物，并能够使这种微生物稳定地分解海藻类的条件。为了降低海藻酸等海藻多糖体的聚合度，通过基于盐酸、有机酸的酸水解法来降低聚合度，从而制备低分子化海藻酸。基于酸的低分子化海藻酸制备法由于在工序上进行过度的酸处理，因而需要将耐酸性装置和废弃的强酸中和后排出，由此需要大量的碱，导致工序成本变贵。但是，通过确立利用来源于鲍鱼的微生物酶，而能够在无需强酸和强碱的温和的反应条件下生成低分子化海藻酸的反应条件，从而需要确立应用从生物工程方面大量生产多糖类的技术来减少海藻类加工工序中派生的废弃物的量，并提高资源的应用度的技术。在自然环境中栖息的微生物的培养方法十分繁杂且非常苛刻。能够从实际环境生态系统分离培养的微生物小于I %，故无法通过传统的培养方法进行培养。为了克服这种困难，正在应用在不进行微生物的分离及培养的情况下，掌握细菌群集的多样性、结构及功能的分子生物学方法。其中，利用最广泛的部分是通过作为利用核酸的分子生物学方法的16S rRNA基因的碱基序列决定来进行系统分类学分析，从而正在活跃进行鉴定及应用此的研究。16SrRNA基因具有按照种类水准划分细菌的信息，该基因的碱基序列的变化对掌握微生物之间的亲缘进化关系十分有用。但是，即使通过分子生物学方法来确认存在于生态系统的微生物信息，分离出微生物并掌握所分离的微生物的特性的过程也对在基因资源的确保方面上起到十分重要的作用。由于需要新颖的功能性食品及发酵性生物资源，因而对于新颖微生物的酶的需求逐渐增加。从海洋生物的肠道(intestinal tracts)分离的裂解酶-生产微生物生产出混合有琼脂糖酶(agarase)、昆布糖酶(Iaminarase)、纤维素酶(cellulase)以及海藻酸裂解酶(alginate lyase)的海藻类-分解酶。18并且，据报道，海藻酸裂解酶按照P -消去机理(elimination mechanism),将微生物的褐藻类分解为a-L-古罗糖醒酸(guluronic acid) (G)、^ -D-甘露糖醒酸(mannuronic acid) (M)、交替的(alternating)MG(GM)以及杂聚的(heteropolymeric)MG(GM)。11 从包含鲍鱼(abalone)及 Psuedoalteromonas sp. IAM14594 (AF082561)> Sphingomonas sp.Al (AB120939)、Klebsiella pneumonia subsp. aerogenes (L19657)> Vibrio sp. QYlOl (AY221030)以及Psuedomonas sp. OS-ALG-9 (AB003330)的多种海洋细菌的内脏分离出这种酶。2’4’13’15迄今，在基因组(Genebank)数据库中所报告的海藻酸裂解酶为230RF程度。24根据以往的研究，许多其他微生物的海藻酸裂解酶按照两种基质特异性划分为G块-特异聚古罗糖醛酸(polyguluronate)裂解酶(EC 4. 2. 2. 11)及 M 块-特异聚甘露糖醒酸(polymannuronate)裂解酶(EC 4. 2. 2. 3)。19最近,发现了通过具有高等植物的根部生长促进、Bifidobacteriumsp.生长速度的加速、人体单核(mononuclear)细胞的细胞毒性细胞因子生产的诱导、IgE的抑制、抗高血压效果等确切的生物学活性的酶来进行分解的海藻酸。5因此，海藻酸裂解酶及海藻酸低聚糖备受食品及医药品产业的研究员的瞩目。利用16s rRNA基因的克隆文库的独立性培养研究提供了 Alpha-、Gamma-、Epsilonproteobacteria及mollicutes相对于作为主要微生物区系的鲍鱼Haliotis discus hannai的内脏里的所有细菌的多样性。21然而,未提供能够通过上述16s rRNA基因的信息获知微生物的生物学功能的有效信息。17’23与此相对地，利用福斯质粒(fosmid)克隆系统的宏基因组文库能够确认难以培养的生物体的新颖基因。1利用直接从福斯质粒载体及处于多种环境的样本分离出的约为40kb的插入(insert)大小的上述筛选系统用于确认几丁质酶(chitinase)、脱氢酶(dehydrogenase)、氧化还原酶(oxidoreductase)、淀粉酶(amylase)、酯酶(esterase)、内切葡聚糖酶(endoglucanase)以及环状糊精酶(cyclodextrinase)等广泛的基因。^2°专利技术者利用宏基因组文库，在鲍鱼的肠内微生物区系中查明了高活性的海藻酸裂解酶基因。在本说明书的全文中，参照引用了多篇论文及专利文献，并标注了引用部分。所引用的论文及专利文献的揭示内容，作为参照结合在本说明书，用以更加清楚地说明本专利技术所属
的水准及本专利技术的内容。
技术实现思路
本专利技术致力于开发出具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及AlyDW。其结果，分离出来源于鲍鱼肠内的微生物来查明了具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶，并查明了这种新颖酶所具有的最佳活性条件，从而完成了本专利技术。本专利技术的目的在于，提供具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。本专利技术的再一个目的在于，提供新颖的海藻酸裂解酶(alginate lyase)。本专利技术的另一个目的在于，提供对新颖的海藻酸裂解酶(alginate lyase)进行编码的核酸分子。本专利技术的还一个目的在于，提供包含上述核酸分子的重组载体。本专利技术的又一个目的在于，提供通过上述重组载体进行转化的细胞。本专利技术的其他一个目的在于，提供海藻酸的分解方法。本专利技术的目的及优点通过下面的具体实施方式、权利要求书及附图变得更加清/E. o根据本专利技术的实施方式，本专利技术提供包含22个ORF的具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。上述22个ORF包含序列目录第一序列的第1280-3652次核苷酸序列、第5025-6128次核苷酸序列、第6365-7492次核苷酸序列、第8687-9202次核苷酸序列、第9206-9823本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：金斗云，申泰善，成治南，白根植，沈秀贞，
申请(专利权)人：全南大学校产学协力团，
类型：
国别省市：
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