用基因工程技术制备唾液酸制造技术

本发明专利技术公开了一种基因工程制备唾液酸的方法。采用重组酶法生产唾液酸的生产工艺，即通过亚克隆的方法将催化唾液酸合成的两个关键酶一异构化酶和唾液酸醛缩酶构建在同一表达质粒中，转化入同一大肠杆菌宿主菌内，通过发酵表达两个重组酶，离心收集菌体，将菌体固定化，用固定化菌体中的多重组酶来催化葡萄糖胺和丙酮酸完成合成反应，得到唾液酸。检测方法是用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。采用本发明专利技术作为唾液酸的生产和检测方法，大大简化了流程和降低了成本，能使生产效率显著提高。

【技术实现步骤摘要】
用基因工程技术制备唾液酸本专利技术涉及基因工程技术制备唾液酸，具体为用唾液酸的重组酶法生产エ艺，利用多酶工程菌技术和多酶ー步催化技术来生产唾液酸。唾液酸(Sialic Acid)是神经氨酸衍生物的通用名，学名叫作“N-こ酰基神经酸”，是ー种天然存在的碳水化合物，通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸及以唾液酸为母体的药物在国外已应用于临床，其最重要的生理作用是(I)用于抑制流感及其它的传染性病毒。(2)可用于神经性疾病、炎症、肿瘤。(3)可用于治疗Alzheimer型老年痴呆症。唾液酸具有抗病毒及抗细菌感染、提高免疫力、中和毒素及抗炎、保护呼吸系统的功能，是燕窝的主要成分，在国外已开发成为预防治疗呼吸道病毒感染和流感的新型药物，因此唾液酸及其衍生物非常有潜力成为预防和治疗传染性病毒的新型药物，并象阿斯 匹林、青霉素等普药ー样生命力长久不衰。据报道，唾液酸的国内外市场年需求量超过100吨，近期全球市场份额在5亿元人民币以上。目前该产品国外已广泛应用，国内处于起步阶段，有着远大的市场前景和巨大的市场潜力，经济效益和社会效益显著。本专利技术成功构建了高效制备唾液酸的工程菌株，专利技术了重组酶法生产エ艺。此方法大大简化了生产エ艺流程，降低了生产成本，有利于进行产业化放大生产。同时，利用固定化多酶工程菌技术为基础，以唾液酸为原料生产唾液酸系列衍生物的技术已经在实验室规模上得到实现。该创新技术还为以后继续开发唾液酸系列衍生物新产品和扩大唾液酸在生物
的应用提供技术支持和建立技术平台。本专利技术采用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液酸与间苯ニ酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，測定唾液酸含量。本专利技术的原理通过亚克隆的方法将催化唾液酸合成的两个关键酶ー异构化酶和唾液酸醛缩酶构建在同一表达质粒中，转化入同一大肠杆菌宿主菌内，通过发酵表达两个重组酶，离心收集菌体，将菌体固定化，用固定化菌体中的多重组酶来催化葡萄糖胺和丙酮酸完成合成反应，得到唾液酸。本专利技术的目的我们专利技术的唾液酸重组酶法生产エ艺，大大筒化了生产エ艺流程，降低了生产成本，有利于进行产业化放大生产。唾液酸的生产方法有天然提取法、发酵法、化学合成法(含酶促合成法)。但由于天然提取法、发酵法成本高，收率低，难以大規模产业化。目前国际上主要采用化学酶促合成法生产唾液酸，但步骤烦琐，纯化困难，产率低，原材料消耗大，尤其是使用的唾液酸醛缩酶需购买但价格昂贵，致使生产成本居高不下。技术方案工程菌种构建一种子液制备一发酵和诱导表达一离心菌体收集一洗涤菌体一多催化酶体的固定化一催化葡萄糖胺和丙酮酸在合适条件下生成唾液酸一提纯、冷冻干燥一唾液酸纯品一产品质量检测最佳实施例1、发酵エ艺从培养基的组成、PH值的影响、搅拌转速和培养时间四个方面对唾液酸基因工程菌培养条件进行了研究。通过对唾液酸基因工程菌培养条件的研究筛选，确定山梨醇为最佳碳源，氯化铵作无机氮源，再进行培养条件的正交实验，获得最佳培养基为山梨醇2. 5%，氯化铵0. 5%，磷酸氢ニ钾90mmol/L，胰蛋白胨I. 5%，硫酸镁0. 04%,PH 7.8。通过研究不同PH值对唾液酸基因工程菌发酵过程中菌体生长和产唾液酸的影响得出，发酵初期PH自然下降时有利于菌体生长，菌体生长对数期较长，最大菌体干重可达6. 9g/L ;发酵中后期PH控制在6. 4时有利于唾液酸的延续合成。通过比较不同搅拌转速对菌体分批发酵生产唾液酸过程的影响，根据发酵前、后期菌体细胞比生长速率和唾液酸比合成速率达到最大值所需搅拌转速的不同，提出了两阶段搅拌转速控制策略发酵前期(0_5h)控制搅拌转速500r/min,发酵中后期控制搅拌转速700r/min。通过对产唾液酸菌株大肠杆菌培养时间进行研究得出在250ml的摇瓶中，装液量为40ml，起始PH值为7. 8，转速250r/min，37°C恒温培养5h，其唾液酸产量可达1001ug/mL ;而如果培养时间延长至6. 5h，可使唾液酸的产量提高到1500ug/mL。2.提取エ艺从洗脱剂种类、洗脱剂浓度、上柱液浓度、上柱流量、起始PH等方面对唾液酸的提取エ艺进行了研究。通过对不同洗脱剂对エ艺影响的研究对比，确定NaCl为最佳洗脱剂，并在NaCl系列浓度下进行洗脱发现，在浓度为0. 15M时得到比较好的提取结果。通过运用不同上柱清液浓度、不同上柱流量和不同洗脱流速，在用0. 15MNaCl洗脱条件下，对获得的结果进行比较，得出最佳的エ艺为上柱清液浓度8000ug/mL，上柱流量(Sv)为 0. 6 (柱体积/小时)，洗脱流速为I. 0 (柱体积/小时)。通过比较不同上柱起始PH对纯化的影响，得出在PH4. 5时能够获得最好的結果。综合上述得出在上柱清液浓度8000ug/mL，上柱流量(Sv)为0. 6 (柱体积/小吋)，上柱起始PH4. 5，洗脱流速为I. 0 (柱体积/小吋)，用NaCl为洗脱剂且浓度在0. 15M的条件下能得到比较好的洗脱效果，获得的唾液酸性质稳定，纯度在95%以上。测定方法本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液酸与间苯ニ酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，測定唾液酸含量。唾液酸对照品溶液(200 u g/ml)的制备精密称取唾液酸对照品10. 52mg(l y g唾液酸相当于3. 24nmol)，置IOml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为唾液酸贮备液(lmg/ml)，按一次使用量分装，-70°C贮存,有效期I年。仅可冻融I次。4°C保存使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液1ml，置5ml量瓶中，加水至刻度，即为每Iml含200 y g的唾液酸对照品溶液，用前配制。测定法取供试品适量，加水稀释至蛋白浓度约为每Iml含0. 2 0. 4mg,作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于IOml玻璃试管中，混匀，每管再加入间苯ニ酚-盐酸溶液(分别量取2%间苯ニ酚溶液2. 5ml,0. lmol/L硫酸铜溶液62. 5 ill、25%盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混匀。试验前4小时内配制)lml，加盖，沸水煮沸30分钟(水浴面高于液面约2cm)，取出置冰浴中3分钟(同时振摇)后，每管加こ酸丁酯-丁醇液(取こ酸丁酯4份与丁醇I份混匀，室温下保存，12小时内使用)2ml，充分混匀，室温放置10分钟，按紫外-可见分光光度法，在波长580nm处测定吸光度。本专利技术的优点本专利技术采用了具有自主知识产权的“重组酶法エ艺”，利用重组多酶工程菌和重组多酶一歩催化技术来生产唾液酸。与其他生产方法相比，本专利技术具有以下优势1.本专利技术采用重组酶法生产エ艺，エ艺简化，有利于进行产业化生产。其他方法采用化学合成エ艺，エ艺复杂；2.本专利技术中催化剂来源是自行发酵生产重组酶，其他方法是购进商品酶；3.在纯度上本专利技术产品达到>99%，而其他方法>97%;4.产品成本上，本专利技术产品成本较其他方法成本明显降低。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种用基因工程技术制备唾液酸的方法，其关键技术在于构建筛选唾液酸基因工程菌株，具体为通过亚克隆的方法将催化唾液酸合成的两个关键酶ー异构化酶和唾液酸醛缩酶构建在同一表达质粒中，转化入同一大肠杆菌宿主菌内，再进行菌种筛选得到基因工程菌，用于唾液酸制备。2.用基因工程技术制备唾液酸的エ艺，其特征在于经过工程菌种构建一种子...

【专利技术属性】
技术研发人员：王革，
申请(专利权)人：王革，
类型：发明
国别省市：