一种枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因序列的表达，首先构建含枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因的质粒PET28a-Baci，然后将PET28a-Baci转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达；最后进行蛋白纯化。本发明专利技术分离获得了枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因序列，并构建了其表达技术体系，表达得到草酸盐脱羧酶，揭示了该酶活性的最佳酶活性，对水稻纹枯病、油菜菌核病等病害有较好的防治效果，是植物病害防治主要的基因资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌BS-916草酸盐脱羧酶基因序列及其应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是ー类好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，是分布在土壌、植物表面和根际的重要微生物种类，能产生一系列代谢产物抑制其它微生物的生长，具有防治植物病害的作用。目前在全世界保存的野生型枯草芽孢杆菌菌株有几百种，研究证实枯草芽孢杆菌能够产生40多种具有不同结构和功能的抗菌物质。枯草芽孢杆菌能产生多种对植物病原真菌具有抑制活性的物质，主要为低分子量的多肽类抗生素和ー些高分子量的蛋白类抗菌物质。申请者实验室前期从枯草芽孢杆菌Bs-916中分离到分子量约为45KDa的抑菌活性蛋白Bacisubin (ZL200610097847. 1)，该蛋白对核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等病菌生长具有明显的抑制作用。利用Q-TOF质谱检测到Bacisubin多个肽段，初步鉴定其为草酸脱羧酶。草酸是多种植物病原真菌重要的致病因子，如核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)和 Septoria musiva 等，在这些病原真菌与寄主相互作用过程中，草酸的分泌为它们的生长、繁殖提供了有利条件，通过调节PH环境调控致病相关基因的表达，增强致病相关酶的活性，并可抑制植物抗病相关的氧化反应。草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase, 0XDC)可催化草酸分解产生甲酸和ニ氧化碳，该催化反应通常需要Mn2+或Mg2+作为辅助因子，并需要O2的參与，该酶与草酸氧化酶同属于cupin蛋白家族，在结构和功能上存在相似之处。草酸脱羧酶最初被发现存在于白腐菌(Pleurotus ostreatus)中，随后发现其存在于多种真菌中，在豚鼠的肝脏中在也发现该酶的存在。枯草芽孢杆菌(Baciilus subtilis)标准菌株BS-168在低pH条件下也可诱导产生草酸脱羧酶，且对由核盘菌的引起的油菜菌核病具有明显的抑制作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌草酸盐脱羧酶基因序列及其应用。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的一种枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因序列，所述基因序列如SEQ ID NO: I所示。一种枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。一种枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因序列的表达，包括如下步骤I)、构建含枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因的质粒PET28a_Baci :利用引物对扩增枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因，在5’端加上GGATCC以构成BamH I识别位点，3’端加上CTCGAG以构成Xho I识别位点，将该开放阅读框片段克隆至大肠杆菌表达载体PET-28a(+)相应的酶切位点中构成质粒PET28a-Baci ；所用弓I物对为BaciF:aaaGGATCCATGTCAAAAGAAAATAACTGCAATATCC ；BaciR:aaaCTCGAGTCAGCATTTCTTTTTGACGACAGGGTGT ；2)、将PET28a_Baci转化至大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS中进行诱导表达将PET28a-Baci 转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS 中，将含有 PET28a_Baci 的 BL21 (DE3) pLysS菌株于LB液体培养基中，取培养菌液以I : 100的比例接种于2XYTA液体培养基中，37° C，200r/min培养至OD6tltl为O. 6，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，30° C诱导表达4h，离心收集菌体；3)、蛋白纯化将步骤(2)中表达的菌体按10%培养液体积悬浮于含O. 5mol/LNaCl的20mmol/L,pH7. O的磷酸钠缓冲液中，超声波破碎，14000r/min离心IOmin,上清液用HisTrapFF柱參照使用说明作进ー步纯化，得到纯化蛋白液，其中平衡和洗脱用缓冲液分别为含20mmol/L和400mmol/L咪唑的上述菌体破碎缓冲液。、所述LB液体培养基为胰蛋白胨IOg ·じ1、酵母提取物5g ·じ1、氯化钠5g ·じ1。所述2XYTA液体培养基为蛋白胨16g ·じ1、酵母提取物· IOg ·じ1、NaCl 5g ·じ1。一种枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶在防治植物病害中的应用。在农业上作为蛋白质农药或抗病基因资源。本专利技术有益效果本专利技术分离获得了枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因序列，并构建了其表达技术体系，表达得到草酸盐脱羧酶，掲示了该酶活性的最佳酶活性，对水稻纹枯病、油菜菌核病等病害有较好的防治效果，是植物病害防治主要的基因资源。附图说明图I :含枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因的质粒PET28a_Baci ；图2:草酸盐脱羧酶基因表达的蛋白电泳图，其中1 :经IPTG诱导的BL21(DE3)pLysS菌株的可溶性蛋白；2 :含有PET28a-Baci质粒的BL21 (DE3)pLysS菌株未经IPTG诱导的可溶性蛋白；3 :诱导表达的可溶性His标签融合蛋白；4 :纯化浓缩后的His标签融合蛋白；图3 :温度对草酸盐脱羧酶活性的影响；图4 :pH值对草酸脱羧酶的酶活性影响；图5 :草酸盐脱羧酶的疏水性分析。具体实施例方式下面结合附图对本专利技术作更进ー步的说明。实施例I、枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因的克隆根据已获得的草酸盐脱羧酶肽段(ZL200610097847. I) VTIVDEKGR和VYIADSTNFK设计简并引物 PEP-F 和 PEP-R，PEP-F AC IATHGTI GA YGARGA, PEP-R :GTIGARTCIGCDATRTA。然后PCR扩增得到草酸盐脱羧酶基因部分序列，PCR扩增条件为94° C，5min ；35X (94° C,30s ；54° C，30s;72。 C，60s);72。 C 5min。将该基因部分序列在NCBI基因数据库中比对获得较高同源性的草酸盐脱羧酶基因，根据该基因设计引物对 Baci-O-Fl ATGTCAAAAGAAAATAACTGC, Baci-O-Rl TCAGCATTTCTTTT TGACGAC，PCR 扩增，扩增条件为94。C，5min ;35 X (94。C,30s ；60° C，30s ；72° C，90s) ；72° C，5min，获得完整基因序列，测序得到枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因序列，如SEQ ID ΝΟ:1所示。实施例2 :枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因表达及蛋白纯化I)、构建含枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因的质粒PET28a_Baci :利用引物对扩增枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因，在5’端加上GGATCC以构成BamH I识别位点，3’端加上CTCGAG以构成Xho I识别位点，将该开放阅读框片段克隆至大肠杆菌表达载体PET-28a(+)相应的酶切位点中构成质粒PET28a-Baci ；所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌Bs？916草酸盐脱羧酶基因序列，其特征在于：所述基因序列如SEQ？ID？NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌BS-916草酸盐脱羧酶基因序列，其特征在于所述基因序列如SEQ ID NO: I 所示。2.一种枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。3.一种枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因序列的表达，其特征在于包括如下步 骤 (1)、构建含枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因的质粒PET28a-Baci:利用引物对扩增枯草芽孢杆菌Bs-916草酸盐脱羧酶基因，在5’端加上GGATCC以构成BamH I识别位点，3’端加上CTCGAG以构成Xho I识别位点，将该开放阅读框片段克隆至大肠杆菌表达载体PET-28a(+)相应的酶切位点中构成质粒PET28a-Baci ； 所用引物对为BaciF: aaaGGATCCATGTCAAAAGAAAATAACTGCAATATCC ；BaciR: aaaCTCGAGTCAGCATTTCTTTTTGACGACAGGGTGT ； (2)、将PET28a-Baci转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达将PET28a-Baci 转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS 中，将含有 PET28a_Baci 的 BL21 (DE3) pLysS菌株于LB液体培养基中，120rpm，摇培12小时，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永锋，于俊杰，陈志谊，聂亚锋，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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