本发明专利技术公开了一种主动靶向型小干扰核糖核酸输送载体，由作为载体骨架的可生物降解的高分子化合物分别与作为载体侧链的靶分子和氨基化合物共价偶联得到。该载体能与siRNA自组装形成复合物纳米粒，将siRNA紧密包裹起来，防止核酸酶对siRNA的降解。另外，该载体中的靶分子能与肿瘤细胞表面的抗原或受体发生特异性相互作用，从而实现将载体-siRNA复合物纳米粒精准地靶向输送至肿瘤部位，通过抗原或受体介导的细胞内吞作用进入癌细胞，在胞内通过siRNA诱导基因沉默复合物的生成，序列特异性降解mRNA，使目的蛋白表达量下调，从而达到杀死癌细胞，实现治疗肿瘤的目的。本发明专利技术还提供了该主动靶向型小干扰核糖核酸输送载体的制备方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种小干扰核糖核酸输送载体，具体涉及一种。
技术介绍
RNA干扰是由双链RNA引发的序列特异性的转录后基因沉默机制。长度约为20个碱基对的小干扰核糖核酸(siRNA)是RNA干扰的效应分 子，在胞内诱导生成基因沉默复合物，序列特异性降解mRNA，从而阻断目标基因的活性。利用siRNA使基因沉寂而调节目的蛋白功能，在很多疾病的基因治疗中有巨大的应用潜力，如神经退行性疾病、癌症、传染病等。siRNA作为一种新药物已经显示出了巨大的应用前景，目前一些生物制药公司已经致力于siRNA药物研发，但目前世界上还没有一例siRNA药物成功上市，这主要是因为siRNA的血浆半衰期短、生理条件下容易被降解、难以输送至细胞质、并且缺乏靶向能力，因此，siRNA的靶向输运是其能否成功上市的关键瓶颈，设计和合成安全有效的siRNA输运载体已经成为目前siRNA药物研发的重要方向。为了克服上述难题，目前已经报道的siRNA输送载体主要有以下四类1)阳离子脂质体类；2)阳离子聚合物类；3)多肽类偶联物；4)抗体融合蛋白体系。这些输送体系能够保护siRNA不被核酸酶降解、有利于siRNA被靶细胞摄取、并具有体内基因沉默效果。其中，由两亲性阳离子聚合物自组装形成的纳米粒子已经被证明能够输送质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA，是核酸输送载体中最有希望的一类。该类载体能够通过离子相互作用装载核酸、保护其不被核酸酶降解、同时提高细胞摄取。新加坡生物工程与纳米技术研究所杨毅严教授课题组报道了一种阳离子纳米粒子及其PEG化衍生物，能输送质粒DNA，在一系列癌细胞中获得高基因表达率。中国科学技术大学王均教授课题组报道了一种可生物降解的两亲性的三嵌段阳离子共聚物，该共聚物作为siRNA输送载体能靶向酸性神经酰胺酶基因以治疗癌症，该三嵌段共聚物为甲基聚乙二醇-聚己内酯-聚-2-胺乙基磷酸乙二醇。新泽西州立大学Tamara Minko教授课题组报道了一种多功能的新型三嵌段共聚物纳米载体，可用于有效的siRNA输送和基因沉默，该共聚物为聚酰胺-聚乙二醇-聚赖氨酸。但是，这些siRNA输送载体在生理条件下，对目标部位的靶向性仍然不够好。在siRNA输送载体上连接上靶分子，可以提高siRNA输送载体对目标部位的靶向性。北京大学罗莹教授课题组报道了一种中性的交联了的树枝状siRNA输送体系，该树枝状siRNA输送体系主体为聚酰胺树枝状聚合物，其末端氨基上修饰了酰肼和乙酰半乳糖胺，修饰后的树枝状聚合物可以与siRNA通过离子相互作用形成复合物，最后用戊二醛对复合物进行交联，以保护siRNA不被降解，体系中半乳糖胺可起到受体介导的主动靶向作用，提高siRNA的靶向输送和基因沉默效果。但是，该载体与siRNA的结合能力不够强，最后需要使用戊二醛对复合物进行交联，以保护siRNA不被降解。根据上述siRNA输 送载体的国内外研究现状分析，设计和合成安全有效的siRNA输运载体、提高siRNA对肿瘤组织的靶向性是研究的主要趋势。
技术实现思路
本专利技术提供了一种，该主动靶向型小干扰核糖核酸输送载体能有效避免siRNA被核酸酶降解，将siRNA高特异性靶向输送至肿瘤部位。一种主动靶向型小干扰核糖核酸输送载体，由作为载体骨架的可生物降解的高分子化合物与作为载体侧链的靶分子和氨基化合物共价偶联得到；所述的高分子化合物、靶分子和氨基化合物含有能发生共价偶联的反应官能团；所述的高分子化合物为具有羧基或者氨基反应官能团的、可生物降解的、无细胞毒性的天然大分子化合物或人工合成的高分子化合物；所述的靶分子为与肿瘤细胞有特异性相互作用的分子；所述的氨基化合物为仲胺、叔胺或季铵盐化合物。本专利技术中，所述的氨基化合物为仲胺、叔胺或季铵盐化合物分子，这类分子在pH中性条件下带正电荷，与siRNA有强结合能力，从而使siRNA输送载体能够结合siRNA并将其包裹起来形成载体-siRNA复合物纳米粒,保护siRNA在体内输送过程中不被降解。所述的靶分子能与肿瘤细胞表面的抗原或受体发生特异性相互作用，实现将载体-siRNA复合物纳米粒精准地靶向输送至肿瘤部位，通过抗原或受体介导的细胞内吞作用进入癌细胞，在胞内通过siRNA诱导基因沉默复合物的生成，序列特异性降解mRNA，使目的蛋白表达量下调，从而达到杀死癌细胞治疗肿瘤的目的。所述的高分子化合物为具有羧基或者氨基等反应官能团的、可生物降解、无细胞毒性的天然大分子或人工合成的高分子。所述的高分子化合物含有羧基或氨基等反应官能团，可进一步用靶分子和氨基化合物来修饰；载体骨架的可生物降解性和无细胞毒性是作为药物输送载体的必要条件。所述的高分子化合物优选为海藻酸钠、壳聚糖或聚赖氨酸，更优选为天然高分子化合物海藻酸钠或壳聚糖，最优选为海藻酸钠。本领域人员熟知的能与肿瘤细胞表面的抗原或受体发生特异性相互作用的靶分子都能应用于本专利技术，为了所述的靶分子能顺利地连接至所述的载体骨架上，靶分子优选为单克隆抗体、叶酸配体、半乳糖胺配体或RGD短肽，所述的RGD短肽为含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽。为了使得所述的氨基化合物能连接到所述的载体骨架上，所述的氨基化合物含有-NH2、醛基或羧基等反应官能团。此外，所述的氨基化合物还能起到质子海绵的作用，在所述的载体-siRNA复合物纳米粒通过胞吞作用进入癌细胞后，内涵体表面的质子泵会将细胞质中的质子泵入内涵体中，由于复合物纳米粒的质子海绵作用，泵入的质子会被载体-siRNA复合物纳米粒吸收，由于渗透压的提高，细胞质中的水会持续进入内涵体，从而使内涵体胀破而释放出复合物纳米粒，逃离溶酶体途径。所述的氨基化合物优选为组胺、组胺醇、5-氨基咪唑-4-甲酰胺、2-(2-甲基咪唑基)乙胺、4-咪唑甲醛、组氨酸和咪唑乳酸中的至少一种。以骨架大分子为海藻酸钠、氨基化合物为组胺、靶分子为半乳糖胺为例，半乳糖胺-海藻酸钠-组胺主动靶向输送siRNA的机理如图I所示。本专利技术中，所述载体骨架上连接的氨基化合物与靶分子的数目比为O. 05-5. O 1，优选为O. 1-1.0 I。此时，所述的氨基化合物能高效地通过离子相互作用结合siRNA,形成载体-siRNA复合物纳米粒,而所述的祀分子也能以较高的效率特异性革巴向肿瘤细胞，提高siRNA的靶向输送效果。本专利技术还提供了所述的主动靶向型小干扰核糖核酸输送载体的制备方法，包括(I)使所述的高分子化合物与所述的氨基化合物和所述的靶分子中任意一个发生共价偶联反应得到中间体；(2)使步骤(I)得到的中间体与所述的氨基化合物和所述的靶分子中另一个发生共价偶联反应，反应完全之后，经纯化得到所述的主动靶向型小干扰核糖核酸输送载体。当所述的高分子化合物的反应官能团为羧基时(如海藻酸钠)，所述的主动靶向型siRNA输送载体的制备方法包括以下步骤(I)用EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)活化所述高分子化合物中的羧基，通过氨基与羧基的共价偶联反应在大分子骨架上共价偶联一种具有氨基的靶分子，如单克隆抗体或半乳糖胺等配体，得到中间体；(2)在步骤(I)得到的中间体上共价偶联一种或几种氨基化合物，如组胺、组胺醇、5-氨基咪唑-4-甲酰胺或2-(2-甲基咪唑基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种主动靶向型小干扰核糖核酸输送载体，其特征在于，由作为载体骨架的可生物降解的高分子化合物与作为载体侧链的靶分子和氨基化合物共价偶联得到；所述的高分子化合物、靶分子和氨基化合物含有能发生共价偶联的反应官能团；所述的高分子化合物为具有羧基或者氨基反应官能团的、可生物降解的、无细胞毒性的天然大分子化合物或人工合成的高分子化合物；所述的靶分子为与肿瘤细胞有特异性相互作用的分子；所述的氨基化合物为仲胺、叔胺或季铵盐化合物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈折玉，吴爱国，任文智，马雪华，
申请(专利权)人：中国科学院宁波材料技术与工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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