一种高纯度他克莫司的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯度他克莫司的制备方法。该方法包括将他克莫司菌丝浸提液通过大孔脱色树脂脱色，然后将他克莫司脱色液导入大孔吸附树脂柱进行吸附、解吸，浓缩解吸液后得到含有他克莫司的粗提物，粗提物用极性溶剂溶解，使用聚合物纳米微球对其进行层析分离，再浓缩结晶干燥即得到高纯度的他克莫司产品。本发明专利技术的制备高纯度他克莫司的方法工艺简单、质量可靠，收率高，可以达到70%以上，溶剂消耗少，适于工业化规模生产药用级他克莫司原料的生产。

【技术实现步骤摘要】
他克莫司为白色结晶，熔点127 129°C，旋光度-84. 4° (c=l. 02，三氯甲烷)。溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或乙醚，难溶于己烷或石油醚，不溶于水。他克莫司具有抑制抗体的产生和移植物的排斥作用及白细胞介素IL-2、IL-3和干扰素IFN-r的产生(海峡药学，2010，22 (11) :148 150)。他克莫司的免疫抑制作用比环孢素A(CsA)强50 100倍(中华器官移植杂志，2000，21 (4) :245 247)，因而大大降低了临床使用剂量，可降低原治疗费用1/3 1/2，同时不良反应也明显降低，用于心脏、肺脏移植有很好效果。美国专利US2006142565报道了一种纯化他克莫司的方法，该方法将他克莫司的提取液通过XAD1180树脂三次纯化后，收集他克莫司纯度高的部分，用乙酸乙酯萃取后浓缩，加入乙酸乙酯、环己烷和水进行结晶，并重复结晶2 3次，得到HPLC纯度为99. 84%的他克莫司产品，收率仅为32. 6%。该方法步骤繁琐，需用树脂进行3次纯化后，再用溶剂结晶 2 3次，收率很低。Lee 等(Lee S Y, et al. J Microbinl. Bintechnol. 1997, 7, 278 281)报道了他克莫司发酵液用二氯甲烷萃取，萃取液浓缩后再用乙酸乙酯结晶。该方法的缺点是萃取剂二氯甲烷不但毒性大，而且沸点低，萃取剂回收率低，造成生产成本较高。Arai ( ARAI一种局纯度他克莫司的制备方法
本专利技术属于工业微生物
，涉及药品原料的制备方法，具体涉及到一种从发酵菌丝体中分离纯化他克莫司的制备方法。
技术介绍
他克莫司(tacrolimus),又名FK506,是一种从筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)产生的23元环的大环内酯类的免疫抑制剂，分子式为C44H69NO12，分子量为 804. 02，结构式如下M. . J. Antibint. Ser. A 1959,13,46 56)描述了一种他克莫司的制备方法，用丙酮萃取发酵液后将萃取液浓缩，得到他克莫司的粗晶体，然后再用甲醇对他克莫司的粗晶体的溶液结晶。该方法的缺点是他克莫司在甲醇溶液中非常容易生成11，11’ -二甲氧基他克莫司，造成结晶收率低，杂质含量高。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一种高纯度的他克莫司的制备工艺，该方法工艺简单、质量可靠，收率高，适于工业化规模生产药用级他克莫司原料的生产。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是，包括以下步骤1)用体积百分浓度为80 95%的极性溶液对他克莫司发酵液分离所得的菌丝体进行浸泡，然后再对浸泡液进行固液分离得到他克莫司浸提液，2)再将此他克莫司浸提液用水稀释至极性溶液体积百分浓度为25% 40%，然后将稀释后的浸提液通过大孔脱色树脂柱进行脱色处理，得他克莫司脱色液；3)将他克莫司脱色液导入大孔吸附树脂柱进行吸附，然后用极性溶剂与水的混合溶液对大孔吸附树脂柱进行梯度解吸，得到他克莫司一次解吸液；4)浓缩一次解吸液，并用乙酸乙酯或者乙酸丁酯萃取，然后分液并浓缩乙酸乙酯相或者乙酸丁酯相，得到他克莫司粗提物；5)将他克莫司粗提物用极性溶剂溶解，注入纳米聚合物微球层析柱；6)使用极性溶剂与水的混合液对纳米聚合物微球层析柱进行梯度解吸，并分段收集他克莫司解吸液，将浓度大于98. 5%的他克莫司解吸液合并，得他克莫司二次解吸液；7)将上述二次解吸液浓缩并加入有机溶剂结晶，然后固液分离干燥后即得到他克莫司精粉。本专利技术的进一步改进在于所述步骤I)的浸泡过程中每千克菌丝体加入2 4升 85 95%的极性溶液。本专利技术的进一步改进在于所述步骤2)脱色处理中所使用的大孔脱色树脂柱为 LX-900或者LSA-700大孔脱色树脂柱；所述步骤3)中大孔吸附树脂柱为XF-800或者DlOl 大孔吸附树脂柱。本专利技术的进一步改进在于所述步骤3)中对大孔吸附树脂柱进行梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的体积百分浓度分别为40 50%和80% 90%本专利技术的进一步改进在于所述步骤6)中对纳米聚合物微球层析柱进行梯度解吸所使用的极性溶剂和水的混合溶液的体积百分浓度分别为45 55%和80% 85%。本专利技术所述极性溶剂的进一步限定在于所述极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇的其中一种。本专利技术的进一步改进在于所述纳米聚合物微球层析柱中的纳米聚合物微球是纳米聚苯乙烯微球或者纳米聚苯乙烯衍生物微球。本专利技术的上述技术方案的进一步改进在于所述聚合物纳米微球为PS-30型纳米聚合物微球或PSA-30型纳米聚合物微球。本专利技术的进一步改进在于所述步骤7)中的有机溶剂为丙酮或乙酸丁酯，丙酮或乙酸丁酯的加入量为浓缩后的二次解吸液体积的2 8倍。本专利技术的进一步改进在于所述步骤7)中的二次解吸液浓缩后的他克莫司浓度为 120mg/mL 150mg/mLo由于采用了上述技术方案，本专利技术所取得的技术进步在于本专利技术的制备高纯度他克莫司的方法工艺简单、质量可靠，收率高，适于工业化规模生产药用级他克莫司原料。本专利技术的方法中通过使用大孔脱色树脂对他克莫司浸提液进行脱色，可以有效去除他克莫司浸提液中大部分的色素，提高浸提液的澄清度和质量。通过再次使用大孔吸附树脂对他克莫司进行富集和纯化，进一步摒弃了发酵过程中所产生的次级代谢产物的干扰，提高目的产物的质量。再通过使用纳米聚合物微球分离纯化他克莫司，可大幅度提高产品的纯度。大孔吸附树脂与纳米聚合物微球解吸过程均采用非连续的梯度解吸法，低浓度的解吸剂可除去大部分色素和强极性杂质，之后采用高浓度的解吸剂解吸，使解吸液的质量得到大幅的提高。利用本专利技术的方法所得的他克莫司纯度可达99. 5%以上，全程总收率大于70%。本专利技术的方法通过使用定量的高浓度的极性溶液对他克莫司菌丝体进行浸泡，使菌丝体中所带有的他克莫司发酵液的色素及其它杂质与菌丝体充分分离，便于后续的脱色及去杂处理。本专利技术解吸所用的极性溶剂以及结晶用的有机溶剂均可以使用常规溶剂，它们毒性小，适宜于工业化生产。附图说明图I :他克莫司的液相色谱图；图2 :他克莫司的13C-NMR图谱；图3 :他克莫司的1H-NMR图谱；图4 :他克莫司的质谱图。具体实施方式下述实施例仅用于阐述实现本专利技术的方法，不应理解为对本专利技术的限制。除非特别言明，本专利技术中所有百分比均为体积百分比。本专利技术所使用的他克莫司发酵液为华北制药集团新药研究开发有限责任公司用微生物培养手段得到的。乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯等试剂均为市售。XF-800、D101型大孔吸附树脂，山东东大化学工业公司。LX-900，LSA-700型脱色树脂，西安蓝晓科技有限公司。聚合物纳米微球为苏州纳微科技公司生产。本专利技术使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。实施例I首先是取发酵单位为487μ g/mL的他克莫司发酵液10L，将他克莫司发酵液进行真空抽滤，使他克莫司发酵液固液分离，得到3. Ikg菌丝体。在此菌丝体中加入95%的乙醇溶液6.2L，浸泡、搅拌I小时后对此溶液进行真空抽滤，并收集他克莫司浸提液。然后用水稀释上述他克莫司浸提液至乙醇体积百分浓度为30%，将此经稀释的浸提液通过装量为500mL 的L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度他克莫司的制备方法，其特征在于：包括以下步骤1）用体积百分浓度为80～95%的极性溶液对他克莫司发酵液分离所得的菌丝体进行浸泡，然后再对浸泡液进行固液分离得到他克莫司浸提液；2）再将此他克莫司浸提液用水稀释至极性溶液体积百分浓度为25%～40%，然后将稀释后的浸提液通过大孔脱色树脂柱进行脱色处理，得他克莫司脱色液；3）将他克莫司脱色液导入大孔吸附树脂柱进行吸附，然后用极性溶剂与水的混合溶液对大孔吸附树脂柱进行梯度解吸，得到他克莫司一次解吸液；4）浓缩一次解吸液，并用乙酸乙酯或者乙酸丁酯萃取，然后分液并浓缩乙酸乙酯相或者乙酸丁酯相，得到他克莫司粗提物；5）将他克莫司粗提物用极性溶剂溶解，注入纳米聚合物微球层析柱；6）使用极性溶剂与水的混合液对纳米聚合物微球层析柱进行梯度解吸，并分段收集他克莫司解吸液，将浓度大于等于98.5%的他克莫司解吸液合并，得他克莫司二次解吸液；7）将上述二次解吸液浓缩并加入有机溶剂结晶，然后固液分离干燥后即得到他克莫司精粉。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪霞，段宝玲，任风芝，李宁，陈书红，刘进怀，李晓露，李丽红，成晓迅，林毅，王海燕，张艳立，朱秀良，董爱华，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：