本发明专利技术涉及一株高产纤维素酶的菌株深绿木霉B-8-1-34（TrichodermaatrovirideB-8-1-34）及其在制备纤维素酶方面的应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术公开的一株深绿木霉B-8-1-34，已于2012年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.6390。本发明专利技术公开的深绿木霉B-8-1-34能够利用含有木质纤维素的工农业生产废弃物，配合麸皮、玉米浆、豆饼粉等廉价原料，通过液态或固态发酵生产纤维素酶，其优势在于发酵周期短，所产纤维素酶活力高，组分合理，水解木质纤维素能力强。本发明专利技术为解决纤维素资源利用中酶活力不高、酶组分不合理导致的生产成本高，糖化效率低等问题提供了新的菌种资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一 株高产纤维素酶的深绿木霉B-8-1-34菌株及其在制备纤维素酶方面的应用，属于微生物
技术介绍
纤维素类物质是自然界中最为丰富的可再生资源之一。将天然纤维素降解为可利用的糖类，再进一步转化为乙醇、菌体蛋白、气体燃料等物质，对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义，而纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂。酶解法的高成本是生物质能源工业化的主要制约因素之一。降低纤维素酶成本主要涉及降低纤维素酶产生菌培养基及发酵成本、提高纤维素酶活性等问题，因此，提供能够利用廉价原料，发酵周期短的菌株产生高活性纤维素酶对木质纤维素转化为生物质能源具有重要的意义。纤维素酶种类繁多，许多微生物特别是真菌具有产生这种复合酶的能力，其中产酶能力较强的有木霉、曲霉、根霉和青霉等，尤以木霉属菌种居多。木霉具有较强的分解纤维素的能力，在木质素、纤维素丰富的基质上生长快。文献“原生质体紫外诱变选育纤维素酶高产菌株”(胡婷婷等化学与生物工程，2008，3，67-67)报道了以绿色木霉为出发菌株，经诱变获得突变菌株UVT12，其CMC酶活达到1020. 24U/g。中国专利技术专利CN200810023480. 8 “一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法”、CN201010040047. 2 “一种高效生产纤维素酶的方法”、CN200910153354. 9 “利用里氏木霉制备纤维素酶”和CN201010176883.3 “一种提高纤维素酶单位活性的液体发酵工艺”公开了利用里氏木霉生产纤维素酶的方法及工艺；专利技术专利CN200710180525. 8 “一种酸性液体纤维素酶的生产方法”、CN200910210154. 2 “一种以造纸短纤维为碳源发酵生产液体纤维素酶的方法”和CN200910259677. 6 “一种液态纤维素酶的制备方法”公开了利用绿色木霉生产纤维素酶的方法及工艺。文樣“Trichoderma atroviride mutants with enhanced productionof cellulase and β -glucosidase on pretreated willow，，(Krisztina Kovacs 等，Enzyme and Microbial Technology, 2008,43 :48 - 55)报道了通过诱变获得了三株深绿木霉 TUB F-1721、TUB F-1741 和 TUB F-1753，滤纸酶活分别达到 I. 14、I. 18 和 I. 14 FPU/ml,η 文献“Enzymatic hydrolysis of steam-pretreated lignocellulosic materialswith Trichodertm atroviride enzymes produced in-house (Krisztina Kovacs 等，Biotechnology for Biofuels, 2009, 2:14)报道了以深绿木霉 TUB F-1663 生产纤维素酶，以小麦秸杆为底物糖化，其水解率达到60-65%，葡萄糖含量达到9. 6 10. 4 g/L，文献“Enzymatic hydrolysis and simultaneous saccharification and fermentationof steam-pretreated spruce using crude Trichodertm reesei and Trichodertmatroviride enzymes，，(Krisztina Kovacs 等，Process Biochemistry , 2009, 44:1323 -1329)以云杉木屑为底物进行糖化，其糖化率达到了 62%，葡萄糖含量达到18. 5 g/L。但距工业化应用还有一定距离。
技术实现思路
本专利技术通过筛选，目的在于提供一株酶活力高的深绿木霉B-8-l-34(7>icAoofe/maatroviriofeB8-1-34)菌株；另一目的在于提供该菌株在生产纤维素酶方面的应用。为实现本专利技术目的，本专利技术以木糖渣为唯一碳源，从自然界分离筛选并经过紫外线和亚硝基胍诱变选育获得了产纤维素酶能力较强的菌株B-8，经分子鉴定，结合形态学特征确定该菌株为深绿木霉(Trichoderma airoririofe),进一步经过诱变选育获得一株高产菌株深绿木霉B-8-1-34。该菌株已于2012年8月10日保藏，保藏号为CGMCC No. 6390。该菌株在制备纤维素酶方面的应用，通过液态发酵实现 ⑴将菌种保藏号为CGMCC No. 6390的深绿木霉B-8-1-34活化后，制成浓度为IO6 IOVmL的孢子悬液，按I 10%的接种量接入种子培养基中，26 32°C，150 220 rpm振 荡培养，得种子液，然后将种子液以2 15%接种量接入液体发酵培养基中，初始pH4. O 6. O,装液量为30 60mL/250mL，于26 32°C，150 220rpm摇床中培养60 96h ； ⑵将步骤⑴获得的发酵液离心分离，取上清液作为粗酶液； 所述的种子培养基组成羧甲基纤维素1%，蛋白胨0.2%，(NH4) 2S04 O. 3%，MgSO4O. 04%，CaCl2 O. 04%, KH2PO4 O. 1%，余量为蒸馏水，各组分以重量百分比计； 所述的液体发酵培养基组成1 5%的玉米秸杆、玉米芯、稻草、稻壳、麦秸杆、高粱杆、木糖渣、甘蔗渣的单一成份或混合物，并添加麸皮O. 05 3%、玉米浆O. 05 5%，蛋白胨O. 05 I. O %或酵母粉O. 05 I. 0%的单一成份或一种以上成份；添加O. 01 O. 5%硝酸钾、O. 02 O. 3%磷酸二氢钾、O. 01 O. 08%硫酸镁和O O. 05%氯化钙；添加O. 01 O. 2mmol/L的硫酸猛、硫酸亚铁或氯化钴,余量为蒸懼水,各组分以重量百分比计。本专利技术也可以通过固态发酵实现 (I)将菌种保藏号为CGMCC No. 6390的深绿木霉B-8-1-34活化后，制成浓度为IO6 IOVml的孢子悬液。将孢子悬液直接接种到固体培养基上或接种至种子培养基进行培养，然后将种子液以2 15%接种量接种至固体发酵培养基培养。装瓶量为6 12 g/250mL,料液比为I :1 2，于26-32°C培养，定期翻料。(2)发酵60 120h，加入缓冲液浸提O. 5 4h，浸提缓冲液为O. 05 mo I/L ρΗ5· O的醋酸-醋酸钠缓冲液或O. 05 mo I/L pH5. O柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其加入量为固体物料重量的8 12倍，固液分离制备粗酶液，测定其FPA、CMC酶活及β -葡萄糖苷酶酶活。所述的固体培养基为PDA固体培养基； 所述的种子培养基组成羧甲基纤维素1%，蛋白胨0.2%，(NH4) 2S04 O. 3%，MgSO4O. 04%,CaCl2 O. 04%,KH2PO4 0.1%，余量为蒸馏水。各组分以重量百分比计。121°C高压灭菌25 min,于26 32°C，150 220rpm摇床中培养18 26h，即本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株深绿木霉B？8？1？34（Trichoderma？atroviride？B？8？1？34）菌株，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.？6390。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴桂馥，吴健，刘允攀，师会勤，高明夫，房晓敏，潘静，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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