一种微紫青霉菌的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种微紫青霉菌的筛选方法及其应用，其中方法包括：采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，将该真菌纯化培养后，进行显微镜镜检分析，观察该真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出微紫青霉菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及真菌的筛选方法及其应用，尤其涉及微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)的筛选方法及其应用。
技术介绍
砷是一种在自然界广泛存在的有毒并且致癌的类金属元素，砷污染已成为全球危害十分严重的环境问题之一。据报道，全球至少5000多万人口正面临着地方性砷中毒的威胁，其中大多数为亚洲国家。中国是受砷中毒危害最为严重的国家之一，在1956-1984年二十多年间，全国曾发生过30余起砷中毒事件。我国又是砷矿大国，砷矿广泛分布在中南和西南部的湖南、云南、广西、广东等省区，砷矿开采或冶炼，含砷农药、化肥等农资产品的过量投入等，可成土壤中砷的累积，进而影响着植物、动物的生长和发育，而且还可以通 过食物链进入人体，对人类的生存和健康构成威胁。目前常用的砷污染土壤修复方法包括土壤改良剂法、溶土法、排土法、化学冲洗法以及生物修复技术。生物修复技术是利用生物(主要是植物和微生物)作用来消减、净化土壤中的砷或改变砷的形态，被普遍认为是砷污染治理中最具应用前景的技术。其中利用超积累植物去除土壤砷的植物修复技术在最近的几年取得了突破性的进展，蜈蚣草(Brakefern，Pteris vitta)和大叶井口边草(Pteris nervosa)等超积累砷的植物相继被发现,并用于砷污染地区的土壤修复。在重金属污染土壤的生物修复技术中，除了应用超积累植物吸收富集金属外，利用植物、微生物将重金属转化为易挥发的有机化合物，使其逸散到大气中，从而去除土壤中的重金属，也逐渐引起了研究者的重视。如Terry等利用微生物和植物的作用，将环境中的硒(Se)转化为生物毒性较低的气态形式(二甲基硒和二甲基二硒)，直接或通过植物的组织使其挥发到大气中。Meagher等将细菌体内的汞(Hg)还原酶基因转入芥子科植物Arabidopsis后,得到的转基因植物能耐受、吸收土壤环境中的Hg,并将Hg2+还原成Hgtl后挥发进入大气。土壤中的砷化合物也可以转变为气态的甲基砷等物质，在多个圈层中迁移和转化。因此，利用某些微生物的对砷的富集、利用和转化、挥发等功能，将種累积到生物体内或将其形成易挥发态砷化合物，已成为潜在的土壤砷污染修复技术之一。目前国内报道的对砷具有挥发能力的真菌还没有，国外报道也屈指可数，且大多还只是局限于理论上和实验室的研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种微紫青霉菌的筛选方法，将微紫青霉菌应用于治理砷污染的土壤中以及减少砷在作物及农产品中的累积。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种微紫青霉菌的筛选方法，包括采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，将该真菌纯化培养后，进行显微镜镜检分析，观察该真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出微紫青霉菌。该微紫青霉菌Penicillium janthinillum已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址标注在后)保存，保存编号为CGMCC No. 3187，保存日期为2009年7月9日。优选地，该方法具体包括将土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400 600mg/L的马丁培养基上分离出真菌；将分离出的真菌经反复纯化、培养后，取直径为8 10_的圆形真菌菌块或边长为8 IOmm的方形真菌菌块放于所述PGP培养基上，在距该菌块为I 3cm处分别放置浸有不同浓度砷溶液的直径为2 4mm的圆形滤纸片，砷浓度的范围设置为1000 IOOOOmg/L ;将所述PGP培养基于24 26°C下培养5天后，通过观察菌株的生长情况筛选出微紫青 霉菌。优选地，马丁培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgSO4 · 7H20、琼脂以及水，各成分的重量比为24 8 2 I 60 4000 ；PGP培养基的成分包括马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为60 8 I 400。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种微紫青霉菌对砷的抗性的鉴定方法，包括在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，由此鉴定微紫青霉菌对砷的抗性。优选地，在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120 125°C下灭菌14 17分钟后，接入O. Iml微紫青霉菌生物量为104cfu/ml的菌悬液，培养温度为24 27°C，转速为138 142rpm,培养5天后，以3800 4200rpm转速进行离心处理8 12分钟，用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后对所述菌质称重，用11 13ml体积比为4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C条件下将该菌质消煮10小时，采用原子荧光测定该菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗该菌质的超纯水混合后作为上清液采用原子荧光测定总砷含量；菌质中的总砷含量作为微紫青霉菌对砷的生物累积量，微紫青霉菌对砷的挥发量=配置的总砷含量-菌质中的总砷含量-上清液中的总砷含量。优选地，参照在总砷含量为50mg/L的PGP培养基中接入微紫青霉菌的处理，分别以在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中不接入微紫青霉菌处理以及在PGP培养基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的处理作为对照，对每项处理均重复多次。优选地，在室内条件下测定在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，具体包括配制总砷含量范围为O 200mg/L的PGP培养基，在120 122°C温度下灭菌14 16分钟后，将生长速率相同的8 IOmm微紫青霉菌菌块分别加入以上处理中，于摇床上温度为23 27°C，转速为138 142rpm振荡培养；培养5天后，培养液以3800 4200rpm离心8 12分钟，并采用稀释梯度法计数菌悬液中的孢子数目，即表达微紫青霉菌生物量；用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后称量该菌质重量，即微紫青霉菌生物量重量。优选地，不同的总砷含量的相应的处理均重复多次。优选地，该方法还包括观察随着培养溶液中总砷含量的增加微紫青霉菌的生物量的变化趋势，并观察微紫青霉菌的生物量最高的总砷含量，由此确定所述微紫青霉菌表现出较强的对砷生物累积与挥发的总砷含量范围。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及农产品中累积方面的应用。通过本专利技术对微紫青霉菌的筛选，可以制成相应的微生物修复制剂，将制得的微 生物修复制剂应用在污染土壤或环境中后，通过该微紫青霉菌对砷的富集和挥发作用，在一定程度上降低土壤中砷的含量，特别是降低土壤中有效砷的含量，从而保证作物正常生长，并使作物及农产品中砷的含量达到无公害农产品要求。附图说明图I为用本专利技术的方法筛选和培养出的微紫青霉菌在浸有不同浓度砷的滤纸片作用下的菌落生长情况；图2为微紫青霉菌在不同砷浓度水平下的生长曲线图。具体实施例方式本专利技术提供的微紫青霉菌的筛选和培养方法，包括从砷污染的土壤中分离真菌，经纯化培养后，利用显微镜镜检。同时，观察分离出的真菌在不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微紫青霉菌的筛选方法，包括：采集砷污染土壤样品，在实验室内从所述土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，将所述真菌纯化培养后，进行显微镜镜检分析，观察所述真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出微紫青霉菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾西柏，苏世鸣，蒋细良，白玲玉，李莲芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，
类型：发明
国别省市：