从海藻提取物中纯化岩藻依聚糖的工艺方法技术

本申请公开了从褐藻提取物中纯化岩藻依聚糖的方法。具体地说，公开了纯化提取物中的岩藻依聚糖以除去重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质的方法。所述方法应用了螯合剂、选择性沉淀和过滤等手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术通常涉及岩藻依聚糖(本文也称为AV513)的生产。更具体地说，本专利技术涉及纯化岩藻依聚糖提取物以除去重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质但不影响期望的生物学活性的方法。
技术介绍
正常的凝血是一个复杂的生理和生化过程，其在几个水平上受到调节。凝血过程涉及凝血因子级联系统的激活，产生纤维蛋白和导致血小板聚集以及血管收缩(Davie等人的综述，Biochemistry30 :10363，1991)。凝结级联系统由“外源性”途径和“内源性”途径构成，外源性途径被认为是引发正常凝血的主要手段，内源性途径则扩展凝血反应。出血损害的正常反应包括激活外源性途径。当血液接触受伤后被暴露于组织上或在组织上表达的组织因子(TF)-因子VII的辅因子时，引发外源性途径的激活。TF与促进产生FVIIa的FVII形成复合体。FVIIa接着结合TF将FX转化为丝氨酸蛋白酶FXa，这是凝血酶原复合物的关键成分。通过FXa/FVa/钙/磷脂复合物将凝血酶原转化为凝血酶刺激了纤维蛋白的形成和血小板的活化，所有这些都是正常凝血所必需的。内源性的途径因子IXa和VIIIa进一步增强正常的止血，这两个因子也可以将FX转化为FXa。也可以见Weitz，J. I.，等人，Chest, 126 (3)，September2004 (Suppl)，265S。硫酸多糖是一类动物和人类中以许多生物学活性为特征且具有良好耐受性的分子。这些聚阴离子分子通常来自植物和动物组织，并且包括广范围的亚类，包括肝素、葡糖氨基聚糖、岩藻依聚糖、交叉菜聚糖、多硫酸戍聚糖(pentosanpolysulfates)和硫酸皮肤素或硫酸葡聚糖。肝素样的硫酸多糖显示通过抗凝血酶III和/或肝素辅因子II相互作用介导的不同抗凝血活性(Toida TC, Linhardt, RJ.，Trends in Glycoscience andGlycotechnology2003 ； 15 :29-46)。尽管有这样的一种硫酸多糖-口服肝素已被考虑作为一种抗凝血剂开发(ADunn，Idrugs, 3 =817-824, 2000)，但是只有肝素是不够的，因为其具有严重的并发症，这些并发症包括术中和术后出血、骨质疏松、脱发、肝素抗性、肝素反跳、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症血栓形成综合症(HITTS)以及其他的缺点，包括中断给药几天后抗凝血作用衰减(Iqbal O 等人，FareedJ, Expert Opin Emerg Drugs6 :111-135,2001 ；Roberts, HR, AnesthesiologylOO =722-730, 2004)。肝素通常胃肠外给药，其口服吸收水平只有大约 I % (Fitton, J. H. , Glycoscience, The Nutrition Science Site,modified JanuaryOI,2005)。与肝素相反，另一种硫酸多糖，岩藻依聚糖，其从海藻分离出来，已经证明能够调节(即加速)凝血(美国专利号2005/0282771)。具体地说，当在体外以低浓度给药或在体内以低的皮下剂量给药时，岩藻依聚糖通过外源性途径途径激活血友病情形下的凝血(Liu, T 等人，和 Johnson, K. ff.，Thrombosis andHaemostasis, 95 :68-76, 2006),这证实了其促凝血活性。更高剂量的岩藻依聚糖能够具有与肝素相似的抗凝血活性。鉴于目前的抗凝血剂如肝素或苄丙酮香豆素(warfarin)的相关问题，因此明确地需要能够克服与目前存在的抗凝血治疗相关的一个或多个问题的药物如岩藻依聚糖。由此，需要一种改进的方法，以经济划算和有效地生产具有最佳活性的富含岩藻依聚糖的提取物，用于促凝血剂或用于抗凝血治疗应用。
技术实现思路
本专利技术基于从海藻提取物纯化岩藻依聚糖的方法中获得的发现。该方法提供高产率的岩藻依聚糖，该岩藻依聚糖基本不含有重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质。因此，本专利技术包括从非均相混合物富集岩藻依聚糖的方法，所述方法包括 (a)提供岩藻依聚糖源；(b)通过用螯合剂处理除去上述源中的重金属离子，产生第一岩藻依聚糖混合物；(C)选择性沉淀所述第一岩藻依聚糖混合物中的岩藻依聚糖，除去污染物；(d)在水溶液中重悬含有岩藻依聚糖的沉淀物，获得第二岩藻依聚糖混合物；(e)重复步骤(C)和(d) —次或多次；和(f)过滤包括岩藻依聚糖的水溶液，除去细菌和内毒素污染物，产生纯化的岩藻依聚糖提取物。在一个实施方案中，所述岩藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一个实施方案中，岩藻依聚糖来自藻类。在一个优选的实施方案中，岩藻依聚糖来自墨角藻属或昆布属(Laminaria)。代表性的岩藻依聚糖来自墨角藻或海带或其他来源,包括但不限于裙带菜和泡叶藻。在一些实施方案中，螯合剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(β -氨乙醚)N，N，N'，N'-四乙酸(EGTA) ,2,3- 二巯基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3- 二巯基琥珀酸(DMSA)。在一个优选的实施方案中，螯合剂是EDTA。在一些实施方案中，螯合剂固定在固体载体上。在一个实施方案中，螯合剂是亚氨基二乙酸螯合树脂。在一些实施方案中，用乙醇选择性地沉淀岩藻依聚糖一次或多次，其中乙醇在岩藻依聚糖混合物中的浓度为约40%到50% (ν/ν)。在一些实施方案中，其pH保持在约5. 7到6. O之间。在一个优选的实施方案中，pH被调节到约5.95。在一些实施方案中，向岩藻依聚糖混合物中加入NaCl，浓度约为20-24g/升。在另一个方面中，本专利技术提供了包括岩藻依聚糖的组合物，岩藻依聚糖通过本文所述的方法产生。在一个实施方案中，岩藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一个实施方案中，岩藻依聚糖来自海藻。在一个优选的实施方案中，岩藻依聚糖来自墨角藻属或昆布属。代表性的岩藻依聚糖来自墨角藻或海带或R村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、粘膜藻(Leathesia difformis)、泡叶藻(Ascophyllumnodosum)、昆布(Ecklonia kurome)、鹿角藻(Pelvetia fastigiata)、单纯性褐条藻(Saundersella simplex)、长松藻(Chordariaflagelliformis)或任何其他种类的含有岩藻依聚糖的海洋植物或动物。在优选的实施方案中，岩藻依聚糖具有生物学活性，例如具有促凝血活性。在一些实施方案中，所述组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂。在另一个方面，本专利技术提供了治疗需要增强凝血的受治疗者的方法，其包括向所述受治疗者给予治疗有效量的包括用本文所述的任何方法产生的岩藻依聚糖的组合物。在一些实施方案中，所述受治疗者具有选自以下的出血疾病慢性或急性出血疾病、血液因子缺乏导致的先天性凝血疾病和获得性凝血疾病。在其它的实施方案中，需要凝血的原因是先前使用了抗凝血剂、手术或其 他侵入性的操作。在一些实施方案中，以约O. Olmg/kg到约I O O mg/kg的剂量给予岩藻依聚糖。本领域技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
从非均相混合物中纯化岩藻依聚糖的方法，所述方法包括：(a)提供岩藻依聚糖源；(b)通过用螯合剂处理除去上述源中的重金属离子，产生第一岩藻依聚糖混合物；(c)选择性沉淀所述第一岩藻依聚糖混合物中的岩藻依聚糖，除去污染物；(d)在水溶液中重悬含有岩藻依聚糖的沉淀物，获得第二岩藻依聚糖混合物；(e)重复步骤(c)和(d)一次或多次；和(f)过滤含有岩藻依聚糖的水溶液，除去细菌和内毒素污染物，产生纯化的岩藻依聚糖。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：帕特里克·N·嘉康利，詹尼弗·巴哈戴维森，斯里尼瓦莎·普拉萨德，科克·约翰逊，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特健康护理股份有限公司，
类型：发明
国别省市：