硫酸化岩藻半乳聚糖隆解酶基因制造技术

编码具有降解硫酸化岩藻半乳聚糖的活性的多肽的基因，所述多肽用于糖链工程试剂、分析包含硫酸化岩藻糖的多糖的结构以及制备所述多糖的降解产物；生产所述多肽的遗传工程方法；以及通过所述方法获得的多肽。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因，所述多肽用作糖技术的试剂，用于对包含硫酸化岩藻糖的多糖的结构分析，或者用于从所述多糖制备更小的分子，本专利技术还涉及使用遗传工程技术产生所述多肽的方法以及通过所述方法获得的多肽。
技术介绍
褐藻包含多种含有硫酸化岩藻糖的多糖。例如，已知包含硫酸化岩藻糖的多糖例如(1)由岩藻糖和硫酸基团组成的硫酸化岩藻聚糖；(2)包含葡糖醛酸、甘露糖、岩藻糖和硫酸基团的硫酸化岩藻葡糖醛甘露聚糖，例如WO 97/26896中描述的包含硫酸化岩藻糖的多糖-U(组成糖的大致摩尔比是岩藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸基团＝10∶7∶4∶5∶20；下文称为U-岩藻多糖)；和(3)由岩藻糖和半乳糖组成的硫酸化岩藻半乳聚糖，如WO 97/26896中描述的包含硫酸化岩藻糖的多糖-F(组成糖的大致摩尔比是岩藻糖∶半乳糖＝10∶1；下文称为F-岩藻多糖)，或者WO 00/50464中描述的包含硫酸化岩藻糖的多糖-G(组成糖的大致摩尔比是半乳糖∶岩藻糖＝2∶1；下文称为G-岩藻多糖)。几乎所有这些包含硫酸化岩藻糖的多糖都是大分子阴离子。因此，它们在各种纯化步骤中的化学行为和物理行为相似，使得难以将它们相互分离。由于这个原因，来自褐藻的包含硫酸化岩藻糖的多糖常常在未将它们相互分离的情况下测定生物活性。因此，难以鉴定出观察到生物活性的包含硫酸化岩藻糖的多糖。目前，已知以下多糖的活性与分子之间的相关关系如Agricultural and Biological Chemistry，44(8)1965-1966(1980)中所述的具有抗凝血活性的硫酸化岩藻聚糖部分，以及如WO 97/26896中所述的引起细胞凋亡诱导活性(对抗肿瘤细胞)的U-岩藻多糖。已经研究过使用硫酸化岩藻聚糖部分来取代肝素作为抗凝血剂。然而，为了将硫酸化岩藻聚糖用作药物，避免未预见到的活性引起的副作用，需要获得高纯度的硫酸化岩藻聚糖。因此，需要寻求用于此目的的方法。至于U-岩藻多糖，为了将其制备成药物，利用其细胞凋亡诱导活性对抗肿瘤细胞，相似地需要方便地获得高纯度的包含硫酸化岩藻糖的多糖-U。因此，需要寻求用于此目的的方法。一般地说，酶降解是多糖结构分析和寡糖生产所使用的最有效方法。此外，使用下面方法，从相互难以分离的多糖混合物中仅能容易地去除一种多糖。使用特异性降解待除去的多糖的酶将所述多糖转化为一种更小的分子。随后对所述混合物进行分子量分级分离，例如超滤。已有报道鲍鱼、扇贝、海胆、海洋微生物等生产降解包含硫酸化岩藻糖的多糖的酶。然而，在生物体中一般仅包含痕量的所述酶。此外，由于所述生物体具有多种包含硫酸化岩藻糖的多糖的降解酶，为获得一种酶需要各种纯化步骤。例如，使用酶活性作为指标，分离如WO 00/50464中所述的硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶，虽然还不清楚该酶是否被分离为单一蛋白。如上文所述，难以纯化和收集大量的单一并且天然存在的硫酸化岩藻糖的降解酶。此外，为了从海洋微生物中获取硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶，有必要在培养物中加入硫酸化岩藻半乳聚糖或包括硫酸化岩藻半乳聚糖在内的包含硫酸化岩藻糖的多糖。因此，存在培养程序复杂化和费用增高的问题。另外还存在以下问题。假如不能如上文所述获得足量的天然存在的硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶蛋白，那么几乎不可能获得有关该酶的氨基酸序列或核苷酸序列的信息。由于在N末端封闭酶蛋白，即使能够得到足量的所述酶蛋白，也无法获知关于N末端氨基酸序列的信息。此外，可能存在以下未曾预料到的问题。即使能够获得编码所述酶的基因，所述基因可能不被表达，或者由于所述基因与表达启动子或宿主之间的不匹配而导致表达水平低下。或者，由于形成内含体，可能无法获得保留酶活性的重组酶。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的基因，所述多肽用作糖技术的试剂，用于对包含硫酸化岩藻糖的多糖的结构分析，或者用于从所述多糖制备更小的分子，以及提供使用遗传工程技术产生所述多肽的方法以及通过所述方法获得的多肽。专利技术简述本专利技术的专利技术人为了揭示褐藻中包含的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的氨基酸序列和核苷酸序列，对来自微生物的产生硫酸化岩藻半乳聚糖的降解酶的基因进行了深入研究。结果本专利技术的专利技术人揭示来自黄杆菌属(flavobacterium)细菌的至少两个基因的存在并测定所述基因的核苷酸序列，所述基因编码各自具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。本专利技术的专利技术人还揭示所述多肽的氨基酸序列。此外，本专利技术的专利技术人已成功开发出具有工业价值的使用所述基因生产各种具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的方法。由此，本专利技术得以完成。本专利技术的第一方面涉及具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽，所述多肽选自(a)包含SEQ ID NO28或30氨基酸序列或其一部分的多肽； (b)具有在SEQ ID NO28或30氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽；和(c)具有与SEQ ID NO28或30氨基酸序列有至少30％同源性的氨基酸序列的多肽。本专利技术的第二方面涉及编码具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的核酸，所述核酸选自以下(a)编码多肽的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO28或30氨基酸序列或其部分；(b)编码多肽的核酸，所述多肽具有在SEQ ID NO28或30氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个氨基酸残基的氨基酸序列；(c)包含SEQ ID NO27或29核苷酸序列的核酸；(d)由在SEQ ID NO27或29核苷酸序列中缺失、添加、插入或取代至少一个核苷酸的核苷酸序列组成的核酸；(e)在严格条件下能够与(a)至(d)中任一项的核酸或它们的互补链杂交的核酸；和(f)具有与SEQ ID NO27或29核苷酸序列有至少50％同源性的核苷酸序列的核酸。根据所述第二方面，提供具有下面活性的多肽转化硫酸化岩藻半乳聚糖成为更小分子，释放至少一种选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的化合物 其中R是H或SO3H。本专利技术的第三方面涉及包含所述第二方面的核酸的重组DNA。本专利技术的第四方面涉及以微生物、动物细胞或植物细胞作为宿主细胞的表达载体，在所述表达载体中插入所述第三方面的重组DNA。本专利技术的第五方面涉及用所述第三方面的重组DNA或所述第四方面的表达载体转化的转化子。本专利技术的第六方面涉及用于生产具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽的方法，所述方法包括培养所述第五方面的转化子；然后从所述培养物收集具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。本专利技术的第七方面涉及通过培养大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/pEA101(FERM BP-8149)或大肠杆菌BL21(DE3)/pEB101(FERM BP-8150)可以获得的具有硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽。本专利技术的第八方面涉及通过将具有所述第一或第七方面的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖而可以获得的更小分子。本专利技术的第九方面涉及从硫酸化岩藻半乳聚糖生产更小分子的方法，所述方法包括使具有第一或第七方面的硫酸化岩藻半乳聚糖降解活性的多肽作用于硫酸化岩藻半乳聚糖。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有降解硫酸化岩藻半乳聚糖活性的多肽，所述多肽选自：（ａ）一种包含ＳＥＱＩＤＮＯ：２８或３０氨基酸序列或其部分的多肽；（ｂ）一种多肽，该多肽具有在ＳＥＱＩＤＮＯ：２８或３０氨基酸序列内缺失、添加、插入或取代至少一个氨基酸残基的序列；和（ｃ）一种多肽，该多肽具有与ＳＥＱＩＤＮＯ：２８或３０氨基酸序列有至少３０％同源性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H上野，友野润，佐川裕章，酒井武，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]