聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，涉及电化学测试技术领域，将超微孔膜材料聚丙烯腈－共聚－丙烯酸先修饰到玻碳电极表面，再采用盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液活化膜微孔内壁上的羧基，将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内，以此制备了一种无标记免疫传感器。通过电化学交流阻抗技术，阻抗相对变化值与抗原浓度对数成正比的关系，建立了一种免疫分析方法。由于使用了功能化的聚合物材料，本发明专利技术的检测方法的电化学阻抗信号得到放大，检测抗原灵敏度更高。本方法可用于人血清中h-IgG的无标记检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及电化学测试技术，以及环境、医学卫生领域中生物分子与细菌的检测
，特别是生物传感器制作
技术介绍
电化学免疫传感器是一种将电化学检测技术与免疫学技术相结合而发展起来的一种新型免疫传感器，这种传感器是将各种各样的特异性抗原(Antigen，Ag)-抗体(Antibody,Ab)固定到电极的表面,通过固定化的分子识别物质和分析物之间的免疫反应，把抗原和抗体这种特异性结合的信息转换为可检测的电化学信号(电流或电位等)。根据测量信号的不同，电化学免疫传感器大致可以分为电导型、电流型、电位型、电容型和阻抗型等多种类型的免疫传感器。 电化学免疫传感器具有很多优点第一，检测快速、实时，如检测一对生物大分子的相互作用时，通常只需要几分钟或者几十分钟，而且在检测过程中，就可以观察到生物分子之间的相互作用的结果；第二，结构、操作简单，不需要昂贵的检测仪器设备，也不需要专门的操作人员，更不需要对生物样品做标记；第三，灵敏度高、检出限低，抗原一抗体的特异性结合决定了免疫传感器的高灵敏度，少受其他干扰；第四，选择性高、特异性好，复杂的样品通常不需要经过分离或者掩蔽处理就能直接测定。这种方法克服了传统酶联免疫分析(ELISA)、柱免疫分析(ICA)、荧光免疫技术(FIAS)、放射性免疫分析(RIA)的抗体标记、辐射危害、背景噪音信号大、繁琐复杂的清洗过程、分析时间长、仪器贵重和需要专业操作人员等缺点。电化学阻抗谱分析方法(EIS)是用来检测修饰有生物分子的电极界面的生物学反应特性的电化学技术，是一种测量电极界面性质的有效工具。阻抗型免疫传感器的分析原理是基于抗原/抗体之间的特异性结合而降低了电活性探针分子同电极之间的电子转移速率，即增加了电子转移阻抗。通过测量免疫反应前后电子转移阻抗之差(—Rrf)可以实现高灵敏检测的目的。近年来，由于电化学阻抗生物传感器具有制备简便、成本低廉、易于封装、快速实时和小型化监测等特点，所以在微生物检测、医疗诊断、药物残留、工业生产、环境检测、食品分析等领域得到广泛研究。 性能优良的免疫材料固定化方法是研制免疫传感技术的核心，成为改善电化学免疫传感性能的最有效途径之一，也一直是传感工作者探索的主要目标之一，并代表当前免疫分子固定化技术的发展方向。因此开发廉价、灵敏度高、特异性好和寿命长的免疫传感器固定化技术已成为研究和探索的目标。聚合物(高分子材料)是指具有相同化学结构的单分子物质，经聚合反应将化学键连接在一起而形成的大分子物质，它因其合成的灵活性、结构的预设性和性质的多样性等特点，在传感器的发展中具有举足轻重的地位。目前研制的阻抗传感器的工作电极多数都是单电极体系，与当今先进的生物芯片相比，其阵列化和微型化程度还需要大大提高，对于检测体系的局部特征研究也很少有报道。所以，发展局部阻抗谱，对研究体系的微观过程势在必行。在随着先进科学技术和微细加工技术的不断革新，在提高电极的品质因数和灵敏度的同时，也要提高电极微阵列的密度和通量，因此，电极阵列化和多通道实时检测是未来阻抗型电化学免疫传感器的研究方向。
技术实现思路
本专利技术目的是提出一种提高电极微阵列的密度和通量的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法。本专利技术技术方案是将超微孔膜材料聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-C0-PAA)先修饰到玻碳电极表面，再采用盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液活化膜微孔内壁上的羧基(-C00H)，将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内。本专利技术公开了一种基于聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-co-PAA)的两亲共聚物修饰玻碳电极，在电极表面形成微孔膜，获得了组合超微电极。在微孔内壁，经盐酸I-乙 基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/ N -羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化微孔膜表面的羧基，以共价键的形式与单克隆抗体结合的方法，固定了抗体，以此制备了一种无标记免疫传感器。通过电化学交流阻抗技术，阻抗相对变化值与抗原浓度对数成正比的关系，建立了一种免疫分析方法。由于使用了功能化的聚合物材料，本专利技术的检测方法与常规电极的电化学交流阻抗测定技术相比，电化学交流阻抗技术，信号得到功能性的放大，检测抗原灵敏度更高，本方法可用于人血清中h-IgG的无标记检测。本专利技术所述盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中，盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合投料摩尔比为I : I。本专利技术所述修饰是将浓度为10 mg/mL的聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-C0-PAA)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液滴涂到玻碳电极上，待二甲基甲酰胺挥发完全之后，用二次水冲洗电极表面。选用聚丙烯腈一共聚一丙烯酸(PAN-co-PAA)的两亲共聚物材料，通过自组装技术，在常规圆盘电极表面自组装，可在电极表面形成纳米级微孔薄膜。本专利技术将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内的具体方法是先将玻碳电极浸入盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中，活化Ih后取出玻碳电极，用二次水洗去表面过量的混合液，再用氮气吹干玻碳电极表面；再将玻碳电极浸入pH为7. O的h-IgG单克隆抗体的磷酸缓冲溶液中，置于4°C下12 h后取出玻碳电极，再将玻碳电极放入20 mg /mL的牛血清蛋白中，置于37. (TC水浴中30 min,以封闭非特异性位点，接着用二次水冲洗除去表面多余的牛血清蛋白，最后，将制备好的电极浸入PH为7.0的磷酸缓冲溶液中，置于4°C条件下保存。上述盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液的浓度为O. 2 mol/L。本专利技术在微孔内壁，经盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/ N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化微孔膜表面的-C00H，以共价键的形式与单克隆抗体结合的方法，达到固定抗体的目的。另，本专利技术所述盐酸I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液的浓度为O. 2 mol/L。所述h-IgG单克隆抗体的磷酸缓冲溶液的浓度为I μ g/mL。附图说明图I为PAN-co-PAA在电极表面形成的微孔膜的扫描电镜图(荷兰Philips公司XL - 30E扫描电子显微镜，电子枪的电压设置为20千伏,样品表面喷金) 图2A为以裸玻碳电极制备传感器在K3 [Fe (CN) 6]中的稳态伏安图。图2B为以本专利技术方法制备的传感器在K3 [Fe(CN)6]中的稳态伏安图。图3A为本专利技术方法制备的传感器检测h-IgG的EIS信号图。 图3B为本专利技术方法制备的传感器检测h-IgG的线性关系图。具体实施例方式一、传感器的制备过程 I、前处理玻碳电极(直径3 mm)首先是用细砂纸抛光处理，然后用超细的Al2O3粉末为抛光粒子，采用丝绸再在玻碳电极表面进行抛光，接着用二次水冲洗。最后，再采用等体积的二次水、乙醇和硝酸的混合溶液进行超声处理。经过预处理后，将玻碳电极在O. 5 mol/L H本文档来自技高网...
【技术保护点】
聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于将超微孔膜材料聚丙烯腈－共聚－丙烯酸先修饰到玻碳电极表面，再采用盐酸1？乙基？3？(3？二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N？羟基琥珀酰亚胺的混合溶液活化膜微孔内壁上的羧基，将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内。
【技术特征摘要】
1.聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于将超微孔膜材料聚丙烯腈一共聚一丙烯酸先修饰到玻碳电极表面，再采用盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液活化膜微孔内壁上的羧基，将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内。2.根据权利要求书I所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述盐酸I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，盐酸I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合投料摩尔比为1:1。3.根据权利要求书I所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述玻碳电极在修饰前经抛光处理，清洗后，再采用由二次水、乙醇和硝酸的混合溶液超声处理，然后将玻碳电极在O. 5 mol/L的H2SOpK溶液中，在-O. 5到+1.4 V范围内进行循环伏安扫描直至获得稳定的伏安曲线为止。4.根据权利要求书3所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述二次水、乙醇和硝酸的混合溶液中二次水、乙醇和硝酸的投料体积比为I : I :Io5.根据权利要求书I所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述修饰是将浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：王赪胤，徐丹，张莉，管俊，胡效亚，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。