瘦素检测试剂盒制造技术

一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。本发明专利技术的瘦素检测试剂盒的检测原理为将重组人瘦素多肽单克隆抗体作为包被抗体微孔板，加待测血清样品，再加相应的酶标抗体，生成包被抗体-待测血清样品-酶标抗体的复合物，添加显色液显色后，再加终止液终止，并用洗涤液洗去残留液，测定待测血清样品的吸光值，与标准曲线比较即可得出待测血清样品中的瘦素含量。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学和医学检验领域，具体涉及一种瘦素检测试剂盒。
技术介绍
随着人类生活水平的提高，肥胖已成为当今世界的一个常见问题。肥胖症是摄食和能耗平衡机制的失调，可引起多种疾病，如II型糖尿病、高血压、高血脂和癌症等。瘦素常被指为肥胖蛋白，是肥胖基因的产物，瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量和糖代谢。尽在脂肪细胞中表达，循环瘦素水平与人体脂肪量呈正相关。瘦素在造血、肾上腺皮质功能中起作用，正常人血清瘦素水平较低，在动脉样硬化、生长激素不稳定、神经性厌食等会出现瘦素的变化。瘦素检测试剂盒是瘦素的血清学诊断的一个常用手段，应用酶联免疫法的基本·原理进行，所述的酶联免疫法也称为酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay),简称ELLSA，ELLSA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量，待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比，瘦素检测试剂盒是现有技术中用于临床肥胖和糖尿病的辅助诊断手段之一，但是现有的瘦素酶标试剂的灵敏度和重复性较差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种瘦素检测试剂盒，该瘦素检测试剂盒的灵敏度高、重复性好。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。本专利技术的瘦素检测试剂盒的检测原理为将重组人瘦素多肽单克隆抗体作为包被抗体微孔板，加待测血清样品，再加相应的酶标抗体，生成包被抗体-待测血清样品-酶标抗体的复合物，添加显色液显色后，再加终止液终止，并用洗涤液洗去残留液，测定待测血清样品的吸光值，与标准曲线比较即可得出待测血清样品中的瘦素含量。本专利技术的瘦素检测试剂盒主要是根据酶联免疫法的原理来测定人血清、血浆和其他样品中的瘦素含量，可用于肥胖症和II型糖尿病的辅助诊断，本专利技术采用重组人瘦素多肽抗原为瘦素参考品，采用重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体为包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素，由上述重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体构成的瘦素检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，在测定瘦素含量的临床检测中发挥重要作用。更进一步，本专利技术的瘦素检测试剂盒，其中所述的包被抗体微孔板为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体6A5，所述的酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体3F7。包被抗体和酶标抗体中的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体主要是根据单克隆抗体在96孔酶标板中的位置进行确定的。所述的洗涤液是由28. 8g 的 Na2HPO4 · 12H20、80g 的 NaCl,3. 9g 的 NaH2PO4 · 2H20、50ml的Tween-20加入纯化水溶解定容至100000ml。所述的显色液包括显色液A和显色液B，显色液A是由浓度为30%过氧化氢用柠檬酸缓冲液稀释至其体积的1000倍所得，显色液B是用含20% 二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成O. 4mg/ml所得。其中所述的柠檬酸缓冲液是由3. 4g乙酸钠和5. 2g柠檬酸溶于5000ml的纯化水所得。所述的终止液为浓度2mol/L的硫酸溶液。本专利技术的瘦素检测试剂盒，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，该重组人瘦素多肽抗原采用本
常规的合成方法所得，即是采用高保真PCR技术从人Cdna文库中的扩增瘦素全长基因，并克隆至pUL，DNA序列分析结果显示克隆的瘦素基因和文献报 导的完全一致，亚克隆L印tin成熟肽编码区段至表达质粒PJW2，构建表达质粒pJL，转化E. coli DH5ci，本专利技术的瘦素检测试剂盒中瘦素参考品可分为5个不同浓度的规格，分别为0ng/ml、lng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml,以便提高本专利技术的瘦素检测试剂盒的灵敏性和重复性。所述的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体由以下步骤制备而成(I)以瘦素参考品免疫6-8周雌性Balb/c小鼠；(2)取上述小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，在浓度为50%的聚乙二醇作用下进行融合得杂交瘤细胞；(3)将上述融合所得的杂交瘤细胞经选择性培养基HAT培养，并筛选出对重组人瘦素多肽抗原有强阳性反应的杂交瘤细胞，即为单抗细胞株；(4)取上述状态良好的数对生长期单抗细胞株，吸管吹下细胞，离心处理所得细胞沉淀以无菌生理盐水悬浮调整至浓度为2X107cellS/ml的细胞悬浮液；(5)将上述细胞悬浮液接种至BALB/C小鼠腹腔，O. 5ml/只；(6) 7天后观察待小鼠腹部膨大发黑即可抽取小鼠腹水；(7)将抽取的小鼠腹水经辛酸-硫酸铵沉淀，透析后获粗制单克隆抗体；(8)再对上述粗制的单克隆抗体进行纯化即可。本专利技术的瘦素检测试剂盒，使用的试剂均符合现行《中国药典》和《中国生物制品主要原辅材料质控标准》要求，未纳入上述标准化学试剂，均为化学纯及以上纯度，所使用的体外诊断试剂聚烯羟滴瓶及其他塑料制品由金坛市鑫宇医疗器械有限责任公司生产，均获国家食品药品监督管理局(SFDA)注册，注册证号为国药包字20040041，所用液体组分按《中国药典》2005年版生物制品无菌试验规程进行，故本专利技术的瘦素检测试剂盒是安全可靠的。附图说明图I是本专利技术的OD值的标准曲线图。具体实施例方式步骤I瘦素检测试剂盒的组成(I) 5 瓶不同浓度规格的瘦素参考品0ng/ml、lng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml, l-3ml/ 瓶；( 2 )包被抗体微孔板；(3)酶标记抗瘦素；(4)洗涤液，20ml/瓶；(5)显色液A、显色液B均为10_15ml/瓶；(6)终止液，15_20ml/瓶。步骤2 重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体的制备，包括以下步骤(I)以重组人瘦素多肽抗原免疫6-8周雌性Balb/c小鼠；(2)取上述小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，在浓度为50%的聚乙二醇作用下进行融合得杂交瘤细胞；聚乙二醇由美国的Sigma生产，分子量为4000 ；(3)将上述融合所得的杂交瘤细胞经选择性培养基HAT培养，并筛选出对重组人瘦素多肽抗原有强阳性反应的杂交瘤细胞，即为单抗细胞株；选择性培养基HAT由美国的Sigma生产；(4)取状态良好的数对生长期单抗细胞株，吸管吹下细胞，离心处理所得细胞沉淀以无菌生理盐水悬浮调整至浓度为2X107cellS/ml的细胞悬浮液；(5)用注射器将上述细胞悬浮液接种至BALB/C小鼠腹腔，O. 5ml/只；(6) 7天后观察待小鼠腹部膨大发黑即可抽取小鼠腹水，通常采用12号注射针头刺入小鼠腹部，并将腹水引流至离心管，一般每只小鼠的抽取量为2-4ml/只，然后将抽取的腹水在转速为3000rpm的离心管中处理5分钟，再用洗管吸取上清液置于洁净盐水瓶内，存放在零下20°C，保质期为2年。(7)抽取的小鼠腹水经辛酸-硫酸铵沉淀，透析后获粗制单克隆抗体；(8)再对上述粗制的单克隆抗体进行纯化即可。具体的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体的纯化包括以下步骤( I)取粗制的单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，其特征在于：所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，其特征在于所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。2.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的包被抗体微孔板为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体6A5，所述的酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体 3F7。3.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的洗涤液是由28.Sg的Na2HPO4 · 12H20、80g 的 NaCl、3. 9g 的 NaH2PO4 · 2H20、50ml 的 Tween-20 加入纯化水溶解定容至 100000ml ο4.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的显色液包括显色液A和显色液B。5.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的终止液为浓度2mol/L的硫酸溶液。6.根据权利要求3所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于，所述的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体由以下步骤制备而成 (1)以瘦素参考品免疫6-8周雌性Balb/c小鼠； (2)取上述小鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋礼华，徐振山，杜贤宇，周业亭，宋社吾，饶海军，
申请(专利权)人：安徽安科生物工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：