一种通过培养龙牙楤木体细胞胚生产有用次生代谢物质的方法，其特征是：1)从无菌实生苗根段获得的胚性愈伤组织分别在分化培养条件和增殖培养条件下进行摇瓶悬浮培养；2)根据体细胞胚不同发育状况定期取材，并计算它们的生物生长量；3)分析体细胞胚各发育时期材料中楤木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮的累积；4)体细胞胚苗中各成分含量最高，总皂苷占栽培植株根中含量的29.7％；齐墩果酸占栽培植株根中含量的29.9％；总黄酮占栽培植株叶中含量的42.8％，且体细胞胚苗中三种物质累积效率最高，分别为：总皂苷6.72mg/周、齐墩果酸3.42mg/周、总黄酮7.36mg/周。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利涉及通过组织培养龙牙惚木体细胞胚发生，体细胞胚苗中三种有用次生代谢物质惚木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮有效累积的培养方法。本专利技术属农业生物
技术介绍
龙牙惚木(Aralia elata Seem.)为五加科落叶灌木或小乔木。其根皮中主要含有惚木皂苷和黄酮类等重要药用成分，而皂苷的主要成分是齐墩果酸型皂苷(王玉萍等，中国中药杂志，1998，23 (9) :519-521)。惚木皂苷和黄酮类具有抗炎、镇静、利尿、强心、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病并发症等多种生理活性及药理作用，且无毒害。近年来的研究显示龙牙惚木皂苷在免疫调节、肿瘤防治方面有很显著的作用，这使其在国际市场上越来越受到人们的关注(王忠壮等，上海第二军医大学出版社，2001)。然而龙牙惚木的野生资源由于·破坏性、掠夺性连年多茬采收，甚至割茎移栽，使其资源接近濒危(高德武等，国土与自然资源研究，2001 (3) :77-78)。而通过细胞培养生产有用次生代谢物是一条可选的解决问题的途径。通常情况下，植物次生代谢物的积累与植物细胞的分化程度有关，分化程度越高，次生代谢物的积累也越多。体细胞胚是一种很好的培养材料。虽然以快繁为目的体细胞胚规模化培养有不少研究报道，例如生物反应器培养挪威云杉(Picea abies)、白云杉(Picea glauca)、仙客来(Cyclamen persicum)、白桦(Betula pendula)的体细胞胚等。而以研究次生代谢物质累积为目的的大量培养的报道却不多。在刺五加体细胞胚培养中，其外植体材料有从胚性细胞开始的，也有从鱼雷胚开始的(邢朝斌等，中草药，2009，40 (8) : 1302-1305)，而且仅仅是考察了其生物生长量，对其中的有效成分未做分析。从胚性愈伤组织到体细胞胚发生发育的过程是细胞有序的分化、发育的过程，而该过程中目的次生代谢物的累积具体如何还未查到相关报道。龙牙惚木方面的研究也未见报道。本专利技术的目的是通过培养龙牙惚木体细胞胚发生，提供一种有效生产三种次生代谢物质(总皂苷、齐墩果酸、总黄酮)的方法，为龙牙惚木规模化培养生产药用产物提供一种培养技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用体细胞胚发生过程中的特殊发育材料，更有效地生产有用次生代谢物质的方法。具体
技术实现思路
如下。将培养萌发7天的无菌实生苗根部切成Icm根段接种到1/2SH+3. Omg/LIBA+0. 2mg/L KT培养条件下诱导胚性愈伤组织，并在同样条件下进行愈伤组织的增殖。将O.8g胚性愈伤组织分别接种入装有50mL分化培养基和增殖培养基的150ml玻璃三角瓶中进行摇瓶悬浮培养，该分化培养基和增殖培养基的组成分别是1/2SH+1. Omg/L IBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖，1/2SH+3. Omg/L IBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖。摇床转速为 110rpm/min。每隔2周继代一次。增殖悬浮培养的胚性愈伤组织4周后取材，烘干称重。分化悬浮培养的愈伤组织培养2周时，细胞分化为球形胚，此时取材，烘干称重。悬浮培养4周后体细胞胚发育到鱼雷和子叶胚时，转入固体培养，在无任何植物生长调节剂的WPM培养基中进行萌发。待生长3周后，取材烘干称重。分析上述所取的愈伤组织、球形和心形体细胞胚、鱼雷和子叶体细胞胚、体细胞胚萌发苗中的惚木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮含量。以6-7月份采集的3-4年生人工栽培苗木根和当年生叶片为对照样品。惚木总皂苷和总黄酮含量分别以齐墩果酸和芦丁为标准品，采用分光光度法分析，监测波长分别为540和510nm。齐墩果酸含量以相同物质为标准品，采用高压液相(HPLC)分析。体细胞胚苗中各成分的含量最高，分别为总皂苷2. 1%，占栽培植株根中含量的29. 7%;齐墩果酸I. 04%，占栽培植株根中含量的29. 9% ;总黄酮2. 3%,占栽培植株叶中含量的42. 8%。分析出各种成分的含量后，根据生长速率(干重g/周)算出其累积效率(mg/周)=各成分含量)*生长速率(mg/周)。上述体细胞胚发生过程的各材料中，体细胞胚苗的三种物质累积效率最高，分别为总阜苷6. 72mg/周、齐墩果酸3. 42mg/周、总黄酮7. 36mg/周。本专利技术中所用的培养基都是按常规处理(调整pH值为5. 8，经过高温高压灭菌(121°C、I. 5个大气压、15分钟))后使用的，培养环境为常规组织培养室(温度24 26°C，光照强度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60% 70% )。本专利技术的优点I、培养材料的生物量快速增值。从细胞到体细胞胚苗是一根有序生长的过程，可在短时间内使培养材料生物量大量增加。2、悬浮培养体系均匀，次生代谢物合成稳定。因为体细胞胚发生发育的材料相对同步，悬浮颗粒大小相对一致。克服了细胞培养过程中细胞无序生长造成的颗粒大小不均匀，悬浮培养系统不稳定的弊端。从而培养材料内次生代谢物的合成较稳定。3、本专利技术为进一步的扩大培养生产有用次生代谢物质提供了依据。附图说明图I体细胞胚发生及其再生:A-根段经4周的培养诱导的胚性愈伤组织；B-增殖的胚性愈伤组织；c-胚性愈伤组织悬浮培养2周后分化形成的球形体细胞胚；D-形成的球形胚的扩大图；E-继续悬浮培养2周后，发育形成的鱼雷和子叶体细胞胚；F-倒入不含植物生长调节剂的WPM固体培养基中培养3周后，萌发形成的体细胞胚苗图2胚性愈伤组织和处于不同发育时期的体细胞胚中总皂苷的量图3标准品(a)和体细胞胚苗(b)的HPLC图谱(箭头表示齐墩果酸峰)图4胚性愈伤组织和处于不同发育时期的体细胞胚中齐墩果酸含量图5胚性愈伤组织及不同发育时期体细胞胚中总黄酮的含量图6胚性愈伤组织及不同发育时期体细胞胚中总皂苷、齐墩果酸、总黄酮的累积效率具体实施例方式实例I龙牙檍木胚性愈伤组织的诱导和增殖I)种子层积及胚培养龙牙惚木(由东北林业大学生命科学学院王秀华教授鉴定)种子采自黑龙江省林业多种经营研究所(牡丹江市)种子园。种子与湿沙混合后于4°C冰箱层积4个月后，选择开荚的、合子胚发育成熟的种子，去除种皮，在超净工作台中先用70%的酒精消毒3分，再用5%次氯酸钠消毒12分钟，然后用灭菌水冲洗5遍。用镊子取出合子胚，接种于事先准备好的1/2MS培养基中，使胚萌发长成无菌小苗。2)诱导胚性愈伤组织及其增殖上述无菌实生苗培养7天后，将其根部切成Icm根段作为外植体，接种到1/2SH+IBA 3. Omg/L+KT O. 2mg/L培养条件诱导胚性愈伤组织，并在同样条件下进行愈伤组织的增殖。实例2分析体细胞胚发育过程中有用物质的累积I)体细胞胚发育过程中的生物增长量将O. 8g胚性愈伤组织分别接种入装有50mL分化培养基和增殖培养基的150mL玻璃三角瓶中进行摇瓶悬浮培养，该分化培养基和增殖培养基的组成分别是1/2SH+1. Omg/LIBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖，1/2SH+3. Omg/L IBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖。摇床转速为 llOrpm/min。每隔2周继代一次。每次取3瓶。增殖悬浮培养的胚性愈伤组织4周后取材，取3-4瓶，烘干称重。分化悬浮培养的愈伤组织培养2周时，细胞分化为球形球形胚，本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术涉及一种通过体细胞胚发生生产有用次生代谢物的方法，其特征在于：组织培养条件下萌发7天的无菌实生苗根段在1/2SH+3.0mg/L？IBA+0.2mg/L？KT培养条件下诱导胚性愈伤组织，并在同样条件下进行愈伤组织的增殖。获得的胚性愈伤组织在分化培养条件(1/2SH+1.0mg/L？IBA+0.2mg/L？KT+20g/L蔗糖)下进行摇瓶悬浮培养，根据发育时期每隔2周取材；4周后，发育为鱼雷和子叶体细胞胚后转入WPM固体培养基中培养3周，体细胞胚萌发为体细胞胚苗；该培养过程中体细胞胚苗相对于球形、鱼类和子叶体细胞胚的生长速率为最快，三种次生代谢物质楤木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮的累积效率最高。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：由香玲，曲冠证，詹亚光，代金玲，陶雷，谭啸，尹静，范桂枝，曾繁琐，齐凤慧，
申请(专利权)人：东北林业大学，由香玲，曲冠证，
类型：发明
国别省市：
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