体细胞胚层积处理和储存的方法技术

一方面，本发明专利技术提供了用于产生层积处理的子叶针叶树体细胞胚的方法。方法包括（ａ）将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为３００ｍＭ／Ｋｇ到４５０ｍＭ／Ｋｇ的发育培养基的培养容器中，在２２℃到２５℃的温度下温育第一段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及（ｂ）将在步骤（ａ）的培养容器中的胚，在０℃到１０℃的温度下进行至少一周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在体外生产植物胚，以及任选从植物胚产生植株的方法。
技术介绍
对针叶树、例如松树和揪树制造木制品的需求持续不断地增加。针对这个问题提 出的一种解决方案是鉴定具有所需特性、例如生长速度快的个体树木，并通过体细胞克隆 产生优势树的大量遗传一致的克隆。体细胞克隆是从雄性和雌性配子之外的树组织产生遗传一致的树木的方法。在体 细胞克隆的一种方法中，将植物组织在含有激素例如植物生长素和/或细胞分裂素的起始 培养基中进行培养，该激素启动能够发育成体细胞胚的胚发生细胞的形成。然后将胚发生 细胞在促进胚发生细胞增殖以形成子叶前胚(即不具有子叶的胚)的维持培养基中继续培 养。然后将增殖的胚发生细胞在促进子叶体细胞胚发育的发育培养基中进行培养，子叶体 细胞胚可以被例如放置在人工种子中，播种在土壤中，在那里它们萌发产生针叶树苗。树苗 可以移植到生长地点进行随后的生长并最终收获，以产生木材或源自木材的产品。为了增加能够萌发以产生松树植株的子叶体细胞胚的生产，对于提高针叶树胚的 体细胞克隆的效率存在着持续的需求。优选，在体外形成的针叶树体细胞胚，与在针叶树种 子中体内形成的针叶树合子胚在物理和生理上是相似或一致的。本专利技术提供了解决对松属 (Pinus)针叶树这种需求的方法。专利技术简述一方面，提供了用于产生层积处理的针叶树子叶体细胞胚的方法。方法包括(a) 将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到 450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22°C到25°C的温度下温育第一段温育时间，该时 间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(b)将培养容器中根据步骤(a)的胚在 0°C到10°C的温度下进行至少1周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。另一方面，提供了产生子叶体细胞胚的方法。方法包括(a)将含有针叶树子叶 前体细胞胚的培养物在第一种发育培养基中或其上温育第一段温育时间；(b)将根据步骤 (a)处理的大量胚分离成单个；(c)将多个分离成单个的针叶树子叶体细胞胚，在含有重量 摩尔渗透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22°C到25°C的温 度下培养第二段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(d)将 培养容器中根据步骤(c)的胚在0°C到10°C的温度下进行至少1周的第三段温育时间，以 产生层积处理的子叶体细胞胚。本专利技术的方法可用于制备成熟的、层积处理的针叶树体细胞胚，它们具有可以通 过例如遗传或生物化学手段进一步表征的增加的萌发率和发芽势，和/或如果需要，可以 萌发以产生针叶树。因此，例如，本专利技术的方法可用于更有效地生产具有一种或多种所需特 性、例如快的生长速度或改进的木材质量的个体针叶树的克隆。附图说明通过结合附图参考下面的详细描述，将更容易认识到并同时更好理解本专利技术的上 述方面以及许多附带优点，其中图1是针叶树体细胞胚的早期和晚期发育的示意图解图2是在处理组1 (对照)条件下产生的萌发物(图2A-2C)， 或在处理组14条件 下产生的萌发物(图2D-2F)的一组照片，证实了使用如实施例2中所述的处理条件14获 得的提高的萌芽发芽势；图2A是来自处理组1的S-框1的萌发物的照片；图2B是来自处理组1的S-框2的萌发物的照片；图2C是来自处理组1的S-框3的萌发物的照片；图2D是来自处理组14的S-框1的萌发物的照片；图2E是来自处理组14的S-框2的萌发物的照片；以及图2F是来自处理组14的S-框3的萌发物的照片。详细描述除非在本文中专门定义，否则本文中使用的所有术语都与它们对于本专利技术的技术 领域中专业人员的含义相同。本文中使用的术语“发育阶段”是指体细胞克隆过程中的一个时期，在此期间在未 成熟的胚中发生了组织发生和组织与器官的生长，以达到能够萌发成植株的全尺寸成熟胚。本文中使用的术语“未成熟胚”是指还不能萌发成植株的胚，包括处于早期发育阶 段的胚(即子叶前胚)和中期发育的胚(即具有尚未完全发育的子叶或下胚轴的胚)。本文中使用的术语“解剖学成熟”是指具有发育好的子叶和下胚轴的胚。本文中使用的术语“子叶胚”是指具有轮廓分明的、延长的双极结构的胚，在一个 末端具有带有一个或多个清晰可见的子叶原基的潜在分生组织中心，在相反末端具有潜在 的胚根。本文中使用的术语“子叶前胚”是指尚未具有子叶的胚。本文中使用的术语“正常萌发物”，表示在评估时存在所有植物的预期部分。植物 的预期部分可以包括胚根、下胚轴、一片或多片子叶，以及上胚轴。在裸子植物的情况下，正 常萌发物的特征为胚根具有超过3mm的长度，与从天然种子萌发的胚的外观相比没有视觉 可辨别的畸形。本文中使用的术语“胚根”，是指植物胚中发育成所生成的植物的初生根的部分。本文中使用的术语“下胚轴”，是指植物胚或苗中位于子叶之下但在胚根之上的部 分。本文中使用的术语“上胚轴”，是指苗茎中在子叶之上的部分。在本文中使用的术语“胚性胚柄细胞团”或“ESM”，是指铺在包含在半固体凝胶中 或作为能够提供物理支持的多孔基质中的液体的营养培养基表面上，并保持生长最长3个 月的细胞团。在3个月的温育期间，体细胞胚从显微镜可见的前体细胞团生长成视觉可见 的早期胚，并最终成为解剖学成熟的胚。在温育几周后，ESM的结构典型地由增殖的簇构成， 所述簇具有几个与培养基直接接触的胚，但是大部分胚形成在仍然增殖的细胞团的顶部或 侧面上。本文中使用的术语“层积处理”是指在萌发前对胚进行冷处理(例如0°C到10°C )。层积处理(冷湿处理)是用于在许多温带物种的种子中克服萌发抗性的处理方法(Taylor & Waring，Plant, Cell, AndEnvironment 2 165-171,1979)。除非另有陈述，否则所有表示为百分率的浓度值都是重量体积百分率。根据本专利技术的方法，意外地发现了将未成熟针叶树的体细胞胚在含有重量摩尔渗 透压浓度为300mM/Kg到450mM/Kg的发育培养基中或其上培养第一段温育时间，然后将胚 在同样的发育培养基中、在0°C到10°C的温度下培养第二段温育时间，与在发育培养基中 温育、然后转移到重量摩尔渗透压浓度低于150mM/kg的层积处理培养基中进行冷处理(层 积处理)的胚相比，产生了增加的萌发率和发芽势，如实施例2-4中所述。除了增加萌发率 和萌发物发芽势之外，省略了发育和层积处理之间的培养基转移步骤还提供了几个其它优 点，包括简化子叶胚的生产，以及任选在萌发之前将胚冷藏在发育培养基上，从而允许了胚 的定时和使用的灵活性。例如，本专利技术的方法允许在田间试验之前积累胚的群体和对它们 进行同步化。根据上述，一方面，提供了用于产生层积处理的针叶树子叶体细胞胚的方法。方法 包括(a)将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为300mM/ Kg到450mM/Kg的发育培养基的培养容器中，在22°C到25°C的温度下温育第一段温育时间， 该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及(b)将步骤(a)的培养容器中的胚 在0°C到10°C的温度下进行至少1周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。本专利技术的方法可用于从本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于产生层积处理的针叶树子叶体细胞胚的方法，包括：（ａ）将含有未成熟的针叶树体细胞胚的培养物，在含有重量摩尔渗透压浓度为３００ｍＭ／Ｋｇ到４５０ｍＭ／Ｋｇ的发育培养基的培养容器中，在２２℃到２５℃的温度下温育第一段温育时间，该时间长度足以使至少一部分胚达到解剖学成熟；以及（ｂ）将步骤（ａ）的培养容器中的胚，在０℃到１０℃的温度下进行至少１周的第二段温育时间，以产生层积处理的子叶体细胞胚。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃米M詹姆鲁斯卡，
申请(专利权)人：韦尔豪泽NR公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]