本发明专利技术主要提供一种高效无性快繁三七再生植物的方法利--用生物反应器大量培养三七体细胞胚。从不定根诱导获得的三七胚性愈伤组织增殖后，在含有0.5mg/L?2，4-D的MS条件下，100％的愈伤组织都产生了球形体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多。10.0g(约1.65×104个)球形胚培养在3L生物反应器内，反应器内装有1.5L不加任何植物生长调节剂的1/2MS液体培养基，空气通入量为0.15vvm。4周后球形胚都发育为子叶体细胞胚，且生物生长量增加约为原来的8倍。液体或固体培养获得的子叶体细胞胚在含加有2.0mg/LGA3的1/2MS培养基中萌发成正常体细胞胚苗，继而在不含任何植物生长调节剂的1/2MS培养基中继代。生长良好的幼苗移栽入装有人工土壤(泥煤苔和泥质岩(3∶1，v∶v))的营养杯中，温室训化成活率较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用小型生物反应器大量培养体细胞胚，简单快速无性繁殖三七再生植株的方法。本专利技术属于农业生物
技术介绍
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)又名田七、金不换、三七参等，为五加科人参属植物，三七为我国传统名贵中药材，主要以块根入药。三七性温，味甘、苦，具有止血镇痛、活血化瘀、滋补强壮和消除疲劳增强体力之功效，传统上常用于治疗咳血、吐血、月·经过多、皮下出血及跌打和刀枪损伤等症，具有多方面的药理作用和保健功能，开发前景广阔。由于三七同为人参属植物，而它的有效活性物质又高于或多于人参，因此又被现代中药药物学家称为“参中之王”。三七从播种至收获，要经三年以上时间(王淑琴等，《中国三七》，1993)，种子又有休眠，需要经过3-6个月的层积处理期才能发芽。因此，利用现代生物技术一诱导体细胞胚发生途径对其进行快速繁殖和种质保存一直是人们研究的问题。刘瑞驹等于1991年首次报道了三七组培苗的再生，他们以幼苗为材料，将茎、叶柄和叶分别进行离体培养，最后均从胚性愈伤组织中分化出胚状体，进而发育成完整植株(刘瑞驹，植物生理学通讯，1991，27(3) :210)。次年，陈伟荣等利用三七花序诱导了胚性愈伤组织，通过体细胞胚发生途径获得再生植株(陈伟荣，华南农业大学学报，1992，13 (3) :69)。许鸿源等用叶片和叶柄作为外植体诱导获得了体细胞胚再生植株(中国中药杂志，2007，32 :481)。尽管对三七体细胞胚发生及其植株再生的研究较多，但是利用生物反应器大量培养三七体细胞胚还未有报道。本专利技术介绍的是利用一种生物反应器培养体细胞胚，快速生产体细胞胚及其小苗的方法。该专利技术为试管苗在生产中的利用打下了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更快、更高效无性繁殖三七再生植物的方法一利用小型生物反应器培养三七体细胞胚快繁再生植株的方法。该专利技术也为三七的分子育种、规模化生产苗木提供技术支持。本专利技术主要是涉及诱导三七体细胞胚发生、发育、苗木移栽等过程中组织培养方法以及利用小型生物反应器(3L)培养大量培养体细胞胚的技术方法等。具体的
技术实现思路
的技术路线包括以下几个部分的内容(I)三七胚性愈伤组织的诱导和增殖首先三七种子进行发芽处理，用发芽的无菌小苗诱导出不定根后，再将不定根切成约Icm的根段,接种到添加有I. Omg/L 2,4_D、30g/L鹿糖和3. Og/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养。5周后诱导出胚性愈伤组织，并进行继代增殖。(2)体细胞胚发生的诱导和体细胞胚发育诱导增殖的胚性愈伤组织接种到含有不同浓度2，4-D的分化培养基中培养。4周后，在含有O. 5mg/L2，4-D处理的条件下，有100%的愈伤组织都产生了体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多。(3)小型生物反应器高效培养体细胞胚将诱导和增殖的胚性愈伤组织转到添加有0-1. Omg/L 2，4_D，30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养，诱导体细胞胚发生。当球形胚形成后，将其接种到装有不加2，4-D的1/2MS液体培养基的三角瓶(IOOml)中培养3周，以确定初始接种量与培养基量比例。然后将10. Og (大约I. 65 X IO4个)球形胚转入3L生物反应器内培养，该反应器内装有I. 5L不加任何植物生长调节剂1/2MS液体培养基，空气通入量为O. 15vvm。4周后球形胚都发育为子叶体细胞胚，且生物生长量增加约为原来的8倍。(4)体细胞胚的萌发和驯化 上述液体或固体培养获得的子叶体细胞胚转入含有一系列浓度的GA3的1/2MS培养基中促进体细胞胚正常萌发成体细胞胚苗。然后三七体细胞胚幼苗转入不加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基中培养。之后，将生长良好的幼苗移栽入装有人工土壤(泥煤苔和泥质岩(3 : l，v : v))的营养杯中，温室(18 25°C)训化3个月后，成活率为66.7%。本专利技术中所用的培养基都是按常规处理(调整pH值为5. 8，经过高温高压灭菌(121°C、I. 5个大气压、15分钟))后使用的，培养环境为常规组织培养室(温度24 26°C，光照强度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60% 70% )。本专利技术的特征能更快更高效的繁殖三七再生植株1)生物反应器的工作量非常大，3L的小型生物反应器一个培养周期就可以生产约I. 65X IO4个体细胞胚；2)由于本专利技术中三七植株再生方式是体细胞胚途径，再生植株能直接萌发成小苗，相对像器官发生途径样，节省了生根过程。附图说明图13L小型生物反应器大量培养三七体细胞胚。A，培养的不定根段(比例尺2.0cm) ；B,不定根在I. Omg/L 2，4_D的MS培养基中培养5周后诱导的胚性愈伤组织(比例尺2. 0cm) ;C，继代扩增的愈伤组织(比例尺2. 0cm) ;D，E，分别是胚性愈伤组织在不加2，4-D(D)和加有O. 5mg/L 2，4_D(E)的MS培养基中培养4周后，分化的体细胞胚(比例尺I. 0cm) ；F, E中分化的球形体细胞胚发育到鱼雷和子叶体胚(比例尺1. 0cm) ;G，悬浮培养E中分化的球形体细胞胚(比例尺1. 0cm) ;H，在不加任何植物生长调节剂的培养基中发育成熟的子叶体细胞胚(比例尺1. 7cm) ;1，通过悬浮培养获得的体细胞胚培养在固体培养基(比例尺3.0mm) ;J，3L生物反应器悬浮培养4周E中的球形体细胞胚(比例尺1.0cm)；K，J中生物反应器培养的体细胞胚(比例尺5. 0mm) ;L，J中生物反应器培养的子叶体细胞胚(比例尺1· 5cm)。图2体细胞胚萌发、植株转化和土壤移栽。A，在不含激素的1/2MS培养中培养的子叶体细胞胚根形成但顶芽生长不好(比例尺5mm) ;B，体细胞胚在含有2. Omg/L GA31/2MS培养基中培养2周后根端和顶芽生长(比例尺1. 2cm) ;C，在1/2MS培养基中培养2个月后顶芽和根端发育良好的体细胞胚幼苗(比例尺1. 2cm) ;D，幼苗移栽入人工土壤中生长3个月后幸存的幼苗(比例尺7mm)；具体实施例方式实例I诱导三七体细胞胚发生、发育I)诱导三七胚性愈伤组织并进行增殖首先三七种子进行发芽处理，用发芽的无菌小苗诱导出不定根后，再将不定根切成约Icm的根段,接种到添加有I. Omg/L 2,4_D、30g/L鹿糖和3. Og/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养。5周后有大约50%的不定根诱导出了愈伤组织。愈伤组织都是从不定根的两端切口地方产生，且松散、乳白色。这些愈伤组织每隔3周在同样的培养基中继代一次，很快增殖。2)诱导体细胞胚发生的和发育 诱导增殖的胚性愈伤组织接种到含有不同浓度2，4_D的分化培养基中培养。4周后，在含有O. 5mg/L2，4-D处理的条件下，有100%的愈伤组织都产生了体细胞胚，有100%的愈伤组织都产生了体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多，为32. 7个。黄色的球形体细胞胚形成于愈伤组织的表层细胞。其他处理体细胞胚的诱导率较低，平均每团愈伤组织产生的体细胞胚的数量较少(表I)。表I不同浓度的2，4-D对体细胞胚分化的影响本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用生物反应器培养体细胞胚快繁三七再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：1)利用无菌生生小苗的子叶、胚根、下胚轴等为外植体，通过常规培养方法获得不定根后，将其切成1cm的根段，接种到添加有1.0mg/L？2，4？D、30g/L蔗糖和3.0g/L？gelrite的MS固体培养基中进行暗培养诱导获得胚性愈伤组织，并在同样的条件下继代增殖；2)将胚性愈伤组织接种到含有0.5mg/L？2，4？D、30g/L蔗糖和3.0g/L？gelrite的MS固体培养基中进行暗培养，100％的愈伤组织都产生了球形体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多；将10.0g(大约1.65×104个)球形胚转入3L生物反应器内培养，该反应器内装有1.5L不加有任何植物生长调节剂的1/2MS液体培养基，通入空气流量为0.15vvm。4周后球形胚都发育为子叶体细胞胚，且生物生长量增加约为原来的8倍；3)上述获得的子叶体细胞胚转入含加有2.0mg/LGA3的1/2MS培养基培养2周萌发成体细胞胚苗，之后转入不加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基中培养；4)将生长良好的幼苗移栽入装有人工土壤(泥煤苔和泥质岩(3∶1，v∶v))的营养杯中，18～25℃温室训化3个月后，成活率为66.7％；5)步骤1)、2)、3)中所用的培养基都是按常规处理：调整pH值为5.8，经过高温高压灭菌(121℃、1.5个大气压、15分钟后使用的，培养环境为常规组织培养室：温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％。...
【技术特征摘要】
1. 一种利用生物反应器培养体细胞胚快繁三七再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤 1)利用无菌生生小苗的子叶、胚根、下胚轴等为外植体，通过常规培养方法获得不定根后，将其切成Icm的根段，接种到添加有I. Omg/L 2，4_D、30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养诱导获得胚性愈伤组织，并在同样的条件下继代增殖； 2)将胚性愈伤组织接种 到含有O.5mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固体培养基中进行暗培养，100%的愈伤组织都产生了球形体细胞胚，且产生的体细胞胚数量最多；将10. Og(大约I. 65X IO4个)球形胚转入3L生物反应器内培养，该反应器内装有I.5L不加有任何植物生长调节剂的1...
【专利技术属性】
技术研发人员：由香玲，詹亚光，李玉花，谭啸，代金玲，陶雷，尹静，
申请(专利权)人：东北林业大学，由香玲，
类型：发明
国别省市：
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