甘蔗褐锈病菌PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及一种甘蔗褐锈病菌的PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测。本发明专利技术的甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有实用性好、准确性高和操作简便快速等优点。为甘蔗褐锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度的快速检测体系，可用于田间甘蔗褐锈病菌的早期诊断及检测，对我国抗褐锈病甘蔗育种和抗褐锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，属于生物

技术介绍
甘鹿褐锈病(Sugarcane brown rust disease)属真菌性病害，由属于黑顶柄锈菌的甘鹿褐锈病菌me I anocephal a)弓\起。该病主要由夏孢子传播,借风力附着在蔗叶表面，经气孔侵入。该病在美国、澳大利亚、印度和毛里求斯等国家普遍发生并多次爆发流行，不仅造成蔗茎产量损失，还对蔗糖分积累造成影响，影响程度因品种抗病性不同而有差异，严重时减产可高达40 %，并导致蔗糖分降低，幅度在10-36 %之间。甘蔗褐锈病主要发生在叶片上，其发生与温度密切相关，16-22 °C为发病最适宜 温度。初次侵染源主要来自甘蔗本身或其他中间寄主。受褐锈病菌侵染后，初期甘蔗叶片上长出黄色小斑点，色泽呈褐色至橙褐色，周围有黄色晕环，后期病斑因夏孢子堆呈脓疱状，最后病斑变黑色，叶组织坏死，使甘蔗叶片失去光合能力，表现早衰。培育抗病品种，提高目标甘蔗品种的抗褐锈病性，并避免栽种感病品种，是控制甘蔗褐锈病的最经济有效的措施。在甘蔗抗褐锈病育种过程中，如何检测目标甘蔗品种中是否含有甘蔗褐锈病菌以及检测的的效率和准确性直接影响甘蔗抗褐锈病育种的进程和效果。目前，一般采取两种方法判断种茎是否带菌一种是采用分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定，黑顶柄锈菌夏孢子橙色或橙褐色，卵圆形至梨形，大小24. I 34. 9X18. I 25.3 ( μ m)，具3 4个芽孔。夏孢子壁四周均匀加厚。冬孢子双细胞，壁光滑，顶壁常加厚，棍棒状，苍白至砖色，大小28. 9 45. 8X14. 5 21. 7 ( μ m);另一种是基于该病害表型症状，因为甘蔗受褐锈病菌侵染后，病害症状表现为受侵染叶片出现褐色条纹病斑，叶片背面表皮破裂，产生锈色脓包，病情严重的叶片枯死，因此，可以采用种茎种植后，观察是否发生甘蔗褐锈病判断待检测甘蔗品种是否含有褐锈病菌。但是，上述的第一种方法由于分离培养以及最终建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；第二种方法则只有当甘蔗、环境条件和病原菌三个因素都具备，病害才能发生，换句话说，即便田间有病原、甘蔗基因型也是感病的，要发生病害，还需要合适的环境条件，三者缺一不可，因此，田间基于诱发的抗病性鉴定方法，鉴定结果难以预料。不同地点、不同年份间的鉴定结果有较大的差异，鉴定结果准确性不够，何况还需要长达几个月的漫长时间。显然，目前已有的技术方法，对于判断种茎是否带菌是不适用的，急需建立一种能够实现“快速”与“准确”目标要求的甘蔗褐锈病菌的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，可用于田间甘蔗褐锈病菌的早期诊断及检测。本专利技术的甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于 1、PCR检测体系的建立:PCR扩增体系为总体积25μ 1，内含2. 5 μ I IOXPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的检测引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因组 DNA，ddH20 补足到 25μ I ； PCR 扩增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 58 °C 45 S，72 °C I min，35 个循环；72 °C 8 min ;所述 10XPCR缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ； 所述检测引物如下PCR-F :5’-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3’，PCR-R :5’-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3'； 2、PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为483bp的位置出现DNA条带，为甘蔗褐锈病菌存在的标志。本专利技术的应用效果 本专利技术的甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有实用性好、准确性高和操作简便快速等优点。I、实用性好直接从待检测甘蔗品种中检测甘蔗褐锈病菌具有重要的实际应用价值。目前，在甘蔗品种及其种质资源交换过程中，甘蔗褐锈病菌的检测方法是根据病菌培养物所产生孢子的形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定，无法满足快速检疫的需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们采用直接从待检测甘蔗品种中提取DNA后直接进行PCR扩增，可在5 6小时内完成对甘蔗褐锈病菌的检测。因此本方法大大提闻了检测的效率。2、准确性高传统的甘蔗褐锈病菌检测技术是根据病原物孢子的形态特征或者根据田间种植后病害表型症状鉴定来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相似种或容易受环境条件的影响，从而导致准确性不高；同时，形态学检测在近缘菌内的不同种之间可区别的特征较少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识和经验，方可作出准确的判断。而本专利技术根据甘蔗褐锈病菌的特异性序列，选择甘蔗褐锈病菌特有的一段保守序列设计特异引物，根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的检测和鉴定提供准确的靶标位点。经过与甘蔗褐锈病菌以及其它不同植物中近缘病原菌的比较，该引物的准确率高。3、操作简便快速应用本专利技术方法，提取待检测植株DNA、PCR扩增和常规琼脂糖凝胶电泳即可判定检测结果，无须对病原菌进行培养或田间种植鉴定，一般检测过程可在5 6小时完成。本专利技术为甘蔗褐锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度的快速检测体系，可用于田间甘蔗褐锈病菌的早期诊断及检测，对我国抗褐锈病甘蔗育种和抗褐锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。附图说明图I为使用甘蔗PCR-F和PCR-R检测引物鉴定6个待检测甘蔗品种是否受甘蔗褐锈病菌侵染(即是否含有甘蔗褐锈病菌)的PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；(代表以水作为模板的空白对照；P代表对应甘蔗品种中含有甘蔗褐锈病菌；N代表对应甘蔗品种中不含甘蔗褐锈病菌；1_6代表6个甘蔗品种。具体实施例方式为了进一步阐明本专利技术而不是限制本专利技术，以下结合实施例加以说明。实施例I甘蔗褐锈病菌PCR检测方法 甘蔗褐锈病菌PCR检测方法，包括以下步骤 I、基因组DNA的提取 (1)取5克待检测甘蔗植株的叶片组织，置研钵，加入液氮磨碎成粉末，并在解冻前转入50 ml的离心管中； (2)加入15ml,65 °C预热的SDS提取液，混匀后在65 1水浴保温40 min ； (3)加8 ml 3 mol/L KAC 混匀后，冰浴 30 min ； (4)25000 g，4 °C离心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1预冷的异丙醇； (5)-20°C放置30 min后，钩出漂浮在液面的DNA，置于一干净的I.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蔗褐锈病菌的PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于：？（1）PCR检测体系的建立：？PCR扩增体系为总体积25？μl，内含2.5？μl？10×PCR缓冲液，2.5？μl？25？mmol/L？MgCl2，0.5？μl？10？mmol/L？dNTP，10？μmol/L？的检测引物PCR？F和PCR？R各1.0？μl，1.25？U？Taq？DNA？Polymerase，20？30？ng基因组DNA，ddH2O补足到25？μl；？PCR扩增程序如下：94？℃？4？min；94？℃？1？min，58？℃？45？s，72？℃？1？min，35个循环；72？℃8？min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100？mmol/L？pH8.5？Tris？HCl，500？mmol/L？KCl和15？mmol/L？MgCl2；所述检测引物如下：？？PCR？F：5“？GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA？3“，PCR？R：5“？GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA？3′；？？？（2）PCR扩增产物的检测：琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为483？bp的位置出现DNA条带，为甘蔗褐锈病菌存在的标志。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阙友雄，许莉萍，罗俊，黄宁，袁照年，郭晋隆，徐景升，陈如凯，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：