本发明专利技术公开了一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白（其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示）。此外，本发明专利技术还公开了上述重组抗原蛋白的制备方法，包括采用RT-PCR扩增EgENO基因，将其克隆到表达载体PET28a(+)中构建重组质粒PET28a-EgENO，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达重组蛋白，用SDS-PAGE及Western?blotting对纯化后重组抗原进行鉴定。此外，本发明专利技术还公开了上述重组抗原蛋白的诊断用途。实验证明，本发明专利技术的重组抗原蛋白对细粒棘球蚴病的诊断具有敏感性和特异性高等优点，在细粒棘球蚴病诊断方面具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种诊断细粒棘球蝴病的重组抗原蛋白；此外，本专利技术还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。
技术介绍
细粒棘球蝴病又称囊型包虫病(cystic echinococcosis, CE)是一种由细粒棘球绦虫的幼虫引起的严重危害人体健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病，且已成为世界范围的一个重要的公共卫生、经济问题。我国是囊型包虫病发病最高的国家之一，其中以西部的新疆、青海、甘肃、宁夏、西川北部等地最为严重，流行区面积占全国总面积的44%以上，严重影响西部农牧民身体健康，是西部农牧区因病致贫、因病返贫的重要原因之一。目前CE确诊主要是通过物理影像，如X线、B超、断层扫描及核磁共振等方法，但由于细粒棘球蝴病患者早期无明显临床症状，这些方法也仅适用确诊中、晚期病患阶段，所以早期诊断对该病 治疗和预后起着重要的作用。对临床早期可疑病患或对高风险人群进行大规模筛查采用免疫学检测显得尤为必要。目前广泛用于细粒棘球蝴病诊断抗原主要是囊液抗原及其组分抗原B和抗原5等，但受到不易标准化，特异性、敏感性不理想以及与其他带绦虫抗原存在交叉反应等问题的限制。寻找具有更高敏感性和特异性的抗原组分，提高对CE的诊断效率，是当前细粒棘球蝴病免疫诊断研究任务中的重要内容之一，而研制特异性快速诊断试剂盒也是目前免疫诊断的发展趋势。随着分子生物学技术的发展，用基因工程技术制备重组抗原有助于解决上述问题。根据不完全统计，我国受细粒棘球蝴病威胁的人口在5000万人以上，但目前对于细粒棘球蝴病(囊型包虫病)的治疗效果尚不理想，所以早期诊断对于人囊型包虫病(CE)的及时治疗至关重要，而具有特异的免疫学诊断对CE的确诊有其重要作用。Enolase是利用免疫蛋白质组学技术用CE病人血清从原头节虫体蛋白中筛选出的一个抗原性蛋白分子，分子量约为50kDa，其编码基因为EgENO (细粒棘球绦虫烯醇酶)，生物信息学分析显示EgENO含有多个B细胞抗原表位,并且蛋白质组分析显示Enolase也存在于原头节排泄分泌物中，提示该分子具有潜在诊断抗原价值。寻找具有更高敏感性和特异性的CE诊断抗原，提高对囊型包虫病的检测效率，是当前细粒棘球蝴病免疫诊断研究课题之一。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种诊断细粒棘球蝴病的重组抗原蛋白。本专利技术要解决的技术问题之二是提供一种用于诊断细粒棘球蝴病的引物。本专利技术要解决的技术问题之三是提供一种上述诊断细粒棘球蝴病的重组抗原蛋白的制备方法。本专利技术要解决的技术问题之四是提供上述诊断细粒棘球蝴病的重组抗原蛋白的用途。为了解决上述技术问题，本专利技术从我国青海省细粒棘球蝴分离原头节cDNA扩增了 ENO基因，克隆表达EgENO重组蛋白，通过ELISA方法评价分析重组抗原的诊断价值。在本专利技术的一方面，提供一种诊断细粒棘球蝴病的重组抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0:1所示。编码上述重组抗原蛋白的基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本专利技术提供一种重组质粒载体，其由上述编码重组抗原蛋白的基因与表达载体PET28a(+)连接构建。所述的连接可以采用本领域常规或已知的方法进行，例如所述的连接可以是将两侧带有限制性内切酶识别位点的细粒棘球蝴抗原蛋白基因与经相同酶切处理的表达载体PET28a(+)连接，构建重组表达质粒。所述的内切酶可以是本领域通常使用的内切酶，例如EcoR I、Xho I。所述细粒棘球蝴抗原蛋白基因的PCR产物可以通过抽取细粒棘球蝴总RNA，反转录成cDNA作为扩增模板，通过PCR法进行扩增而得。本专利技术提供一种转化体，其由上述重组质粒载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)而得。··所述的转化可以按照本领域的常规或已知的方法进行。在本专利技术的另一方面，提供一种用于诊断细粒棘球蝴病的引物，其序列为h游:5’ -GTAGAATTCATGTCCATCTTAAAGATCC-3’ (如 SEQ ID NO:3 所示)或其互补链；下游5’-ATACTCGAGTTACAAAGGATTGCGGAAG-3’ (如 SEQ ID N0:4 所示)或其互补链。在本专利技术的另一方面，提供一种上述诊断细粒棘球蝴病的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤I) EgENO基因扩增，EgENO基因扩增的具体序列如SEQ ID NO: 2所示；2)重组质粒构建和鉴定，采用的重组质粒载体为PET28a(+)；3)重组蛋白的诱导表达及纯化。步骤I)具体为设计SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，抽取细粒棘球蝴总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增。所述RT-PCR扩增的反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性lmin，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；最后72°C延伸lOmin。步骤2)具体为将步骤I)所得的PCR产物与经EcoRI和XhoI双酶切后的表达载体PET28a(+)连接，转入大肠杆菌DH5a，并培养过夜；筛选阳性菌落提取质粒，双酶切鉴定并测序，将测序无误的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)。步骤3)具体为将重组菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达，分别收集诱导前及不同诱导时间菌液，进行SDS-PAGE电泳分析；离心收集菌体，用纯化缓冲液重悬，冰浴，后冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀进行可溶性分析；按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。在本专利技术的另一方面，提供一种上述重组抗原蛋白在制备诊断细粒棘球蝴病药物中的应用。在本专利技术的另一方面，提供一种上述重组抗原蛋白在制备细粒棘球蝴病诊断试剂盒中的应用。本专利技术从我国青海省细粒棘球蝴包囊中分离原头蝴，抽提总RNA，采用RT-PCR扩增EgENO基因，将其克隆到原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a_EgEN0，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达重组蛋白，用SDS-PAGE及Western blotting对纯化后重组抗原进行鉴定分析，对32例囊型包虫病、24例泡型包虫病、5例日本血吸虫病、5例弓形虫病、5例华支睾吸虫病、4例囊尾蝴病、2例肺并殖吸虫病和16名健康人共93份血清进行ELISA检测，评价重组抗原的免疫诊断效果。双酶切鉴定及测序结果均显示重组质粒PET28a_EgEN0构建成功，SDS -PAGE及Western blotting分析显示重组质粒在大肠杆菌BL2KDE3)中获得高效表达，重组蛋白相对分子质量约为50000，可被囊型包虫病患者混合血清识别；该重组抗原对CE血清的诊断敏感性为81. 25%，特异性为100% (除泡型包虫病人血清)。实验证明，本专利技术的EgENO重组抗原对细粒棘球蝴病的诊断具有敏感性和特异性高等优点，具有较好的诊断价值，为研制相关诊断试剂盒奠定了基础，在细粒棘球蝴病诊断方面具有广泛的应用前景。附图说明图I是本专利技术实施例中EgENO基因的RT-PCR扩增结果示意图，其中，M表示DNA标志物，I表示EgENO PCR扩增产物；图2是本专利技术实施例中重组质粒酶切鉴定结果示意图，其中，M表示DNA标志物，I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹建平，王莹，沈玉娟，袁忠英，周何军，徐馀信，张璟，王燕娟，伍卫平，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。