本发明专利技术公开了一种抗猪圆环病毒2型病转基因猪的构建方法。目前在该病的防治领域，从技术上取得的效果上收效甚微。本发明专利技术方法首先设计能有效阻止猪圆环病毒2型病增殖和复制的靶向基因shRNA；其次获得能有效阻止猪圆环病毒2型病感染的胚胎成纤维细胞克隆；然后借助核移植、胚胎移植技术和常规育种技术培育抗圆环病毒2型转基因猪；最后检测抗圆环病毒2型病转基因猪基因组中目的插入基因。本发明专利技术从遗传的角度根除猪圆环2型病毒的感染，减少养猪的疫病控制成本，减少猪圆环病毒对环境的污染，为生命科学研究提供合格的实验用猪，从根本改变疫病控制的传统策略，开启一个疫病控制研究的新时代。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因生物
，具体涉及。
技术介绍
断奶仔猪多系统衰竭综合征(现名猪圆环病毒相关疾病)是1997年由加拿大学者首先报道的一种新病，是目前在世界范围内广泛流行、对养猪业构成巨大威胁的一种免疫抑制性病毒传染病。PCV2型病毒(Porcine Circovirus Type 2,即猪圆环病毒2型)在猪场引起的极为普遍感染是我国猪场疫病复杂的重要原因，可以说它对养猪产业正常维持带来了极大的困难，其对我国养猪产业的影响目前受到了仅次于高致病性蓝耳病的空前关注。为此，PCV2型病毒感染是我国养猪业生产、与猪相关的生命科学研究与产品开发亟待解决 的重大问题，具有时间的紧迫性。虽然病毒学家和动物传染病学家付出了艰辛的努力，一直在寻求免疫控制PCV2型病毒技术上的突破，面对猪群如此普遍的感染以及PCV2型病毒独特的生物学特性，目前在该病的防治领域，从技术上取得的效果上收效甚微。转基因技术的发展，为其提供了新的曙光。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供，来控制猪圆环病毒2型病感染和减少其危害。本专利技术方法实现步骤如下 步骤(I).设计能有效阻止猪圆环病毒2型病增殖和复制的靶向基因shRNA。1-1.根据PCV2型病毒的基因组序列，以R印基因和Cap基因为目的基因，在每个目的基因内选取一段19bp长的核酸序列；该核酸序列不在5’和3’非翻译区，且起始密码子后75bp ;将选取的19bp核酸序列，与猪的基因组进行比对，确定该19bp核酸序列是特异性的，只针对目的基因，与其他基因没有相似性；根据以上原则设计针对Rep基因的靶向基因shRNA 139对，针对Cap基因的靶向基因shRNA 134对。1-2.体外靶向基因shRNA活性检测；将合成的针对Rep基因和针对Cap基因的靶向基因shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，且直接连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上,构建成RNA干扰载体；将上述RNA干扰载体中的DNA,在转染试剂脂质体2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen)介导下导入PK15细胞，转染24小时后对经转染的PK15细胞进行荧光观察，对成功转染的PK15细胞接种PCV2型病毒，接毒48 72小时后将上清悬液和PK15细胞分开收集，通过免疫荧光的方法分别测上清悬液和PK15细胞中的病毒TCID5tl,以病毒TCID5tl值判断靶向基因shRNA活性及对PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID5tl值越大，靶向基因shRNA活性弱，对PCV2型病毒的抑制作用越小。所述的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 载体购置于 Clonetech 公司。步骤(2).获得能有效阻止猪圆环病毒2型病感染的胚胎成纤维细胞克隆。2-1.构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体。经步骤1-2筛选出有效阻止猪圆环病毒2型病感染的靶向基因shRNA,构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体pGK-zsGFP-shRNA和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA (构建方法见专利号ZL200910152602. 8，专利技术名称用于生产转基因猪的PiggyBac转座载体及其构建方法)。2-2.克隆胚胎成纤维细胞。将步骤2-1构建的抗猪圆环病毒2型病转基因载体 pGK-zsGFP-shRNA 和 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA 分别用转染试剂脂质体 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)转染猪胚胎成纤维细胞；转染24小时后,猪胚胎成纤维细胞经胰酶消化后用有限稀释法克隆。在荧光显微镜下观察这些经克隆的猪胚胎成纤维细胞GFP的表达情况，选取含GFP的猪胚胎成纤维细胞。步骤(3)借助核移植、胚胎移植技术和常规育种技术培育抗圆环病毒2型转基因猪。3-1.猪卵母细胞的采集和成熟培养。将猪的卵巢用39°C含双抗的磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗涤多次，然后将卵巢放置于39°C水浴锅中，用带有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上2 6mm的卵泡，将抽取的卵泡液注入无菌捡卵杯中，用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(PVA-TL-HEPES)缓冲液洗涤两次。在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀，并包裹有两层以上致密卵丘细胞的卵丘一卵母细胞复合体，并将它放在卵母细胞成熟液中，在5%C02 ’ 39°C下培养42 44小时，然后加入透明质酸酶，漩涡振荡I分钟。3-2.制备供体细胞。将步骤2-2构建的表达GFP的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取出，迅速进行复苏。复苏后，猪胚胎成纤维细胞长至80 90%的汇合状态时，加入从培养箱中取出胰酶消化细胞，制成细胞悬液。将细胞悬液分装到I. 5ml的离心管中，用含10%血清的PVA-TL-HEPES缓冲液洗一遍，然后离心力250Xg离心10分钟，重悬在O. 5ml的磷 酸缓冲液中，如此处理后的猪胚胎成纤维细胞即为供体细胞，并放入4°C冰箱内备用。进行核移植操作前20min，将制备好的供体细胞从冰箱中取出放入39°C培养箱中孵育，用移液枪吸取10 μ I的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，用石腊油覆盖。3-3.采用盲吸法为成熟卵母细胞去核，在直径IOOmm培养皿加入100μ I显微操作液滴，再用矿物油覆盖，39°C预热后把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入显微操作液滴，然后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜上用内径20 30 μ m,外径120 150 μ m的固定吸管吸持成熟卵母细胞，用内径20 25 μ m的去核/注射针使第一极体处于钟表4点钟位置，并从3点钟处进针，吸取第一极体及其临近10 30%可能含有卵母细胞核的胞质。3-4.去核的成熟卵母细胞的注核操作。在显微操作台培养皿的中央滴内置入去核的成熟卵母细胞，每次置入10 15个，培养皿中央滴周围的几个滴内置入供体细胞。首先用内径为15 20 μ m的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台，将去核的成熟卵母细胞置于视野下，并用固定针固定，用注核针拨动去核的成熟卵母细胞，找到步骤3-3去核时在透明带留下的进针口，使进针口在3点钟位置并将内径为15 20 μ m的注射针通过该进针口插入到透明带下，将供体细胞注入去核的成熟卵母细胞的卵周隙内，构成一个卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并整理透明带，使供体细胞与去核的成熟卵母细胞膜相互接触，便于之后重组胚的融合。3-5.融合。将卵-供体细胞复合体移入融合液中，洗涤三次后移入融合槽中，用毛细实心玻璃管拨动卵-供体细胞复合体，使其接触面与电流方向垂直，然后对卵-供体细胞复合体进行电击，电击参数为120 volts, 30us, 2puls。将激活后的卵-供体细胞复合体迅速移入基础培养液中洗涤3 5次，然后置入39°C、5%C02、100%湿度培养箱中培养4小时。3-6.胚胎移植入代孕母猪。选择发情的母猪，于手术当天早上对母猪禁食。手术前绑定母猪，并采用戊巴比妥钠水溶液结合异氟烷方法麻醉。手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位，用清水清洗手术部位及四周，擦干后用碘酒对手术部位及四周进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗猪圆环病毒2型病转基因猪的构建方法，其特征在于如下步骤：步骤(1).设计能有效阻止猪圆环病毒2型病增殖和复制的靶向基因shRNA；1？1.根据PCV2型病毒的基因组序列，以Rep基因和Cap基因为目的基因，在每个目的基因内选取一段19bp长的核酸序列；该核酸序列不在5’和3’非翻译区，且起始密码子后75bp；将选取的19bp核酸序列，与猪的基因组进行比对，确定该19bp核酸序列是特异性的，只针对目的基因，与其他基因没有相似性；根据以上原则设计针对Rep基因的靶向基因shRNA？139对，？针对Cap基因的靶向基因shRNA？134对；1？2.体外靶向基因shRNA活性检测；将合成的针对Rep基因和针对Cap基因的靶向基因shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，且直接连接到线性化的RNAi？Ready？pSIREN？RetroQ？ZsGreen载体上，构建成RNA干扰载体；将上述RNA干扰载体中的DNA，在转染试剂脂质体2000介导下导入PK15细胞，转染24小时后对经转染的PK15细胞进行荧光观察，对成功转染的PK15细胞接种PCV2型病毒，接毒48～72小时后将上清悬液和PK15细胞分开收集，通过免疫荧光的方法分别测上清悬液和PK15细胞中的病毒TCID50，以病毒TCID50值判断靶向基因shRNA活性及对PCV2型病毒的抑制作用，病毒TCID50值越大，靶向基因shRNA活性弱，对PCV2型病毒的抑制作用越小；所述的RNAi？Ready？pSIREN？RetroQ？ZsGreen载体购置于Clonetech公司；步骤(2).获得能有效阻止猪圆环病毒2型病感染的胚胎成纤维细胞克隆；2？1.？构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体；经步骤1？2筛选出有效阻止猪圆环病毒2型病感染的靶向基因shRNA,构建抗猪圆环病毒2型病转基因载体pGK？zsGFP？shRNA和PXL？BAC2？FRT？EGFP？NEO？shRNA；2？2.？克隆胚胎成纤维细胞；将步骤2？1构建的抗猪圆环病毒2型病转基因载体pGK？zsGFP？shRNA和PXL？BAC2？FRT？EGFP？NEO？shRNA分别用转染试剂脂质体2000转染猪胚胎成纤维细胞；转染24小时后，猪胚胎成纤维细胞经胰酶消化后用有限稀释法克隆；在荧光显微镜下观察这些经克隆的猪胚胎成纤维细胞GFP的表达情况，选取含GFP的猪胚胎成纤维细胞；步骤(3)？借助核移植、胚胎移植技术和常规育种技术培育抗圆环病毒2型转基因猪；3？1．猪卵母细胞的采集和成熟培养；将猪的卵巢用39℃含双抗的磷酸缓冲液洗涤多次，然后将卵巢放置于39℃水浴锅中，用带有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上2～6mm的卵泡，将抽取的卵泡液注入无菌捡卵杯中，用4？羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤两次；在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀，并包裹有两层以上致密卵丘细胞的卵丘－卵母细胞复合体，并将它放在卵母细胞成熟液中，在5%CO2？，39℃下培养42～44小时，然后加入透明质酸酶，漩涡振荡1分钟；3？2．制备供体细胞；将步骤2？2构建的表达GFP的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取出，迅速进行复苏；复苏后，猪胚胎成纤维细胞长至80～90%的汇合状态时，加入从培养箱中取出胰酶消化细胞，制成细胞悬液；将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10%血清的PVA？TL？HEPES缓冲液洗一遍，然后离心力250×g离心10分钟，重悬在0.5ml的磷酸缓冲液中，如此处理后的猪胚胎成纤维细胞即为供体细胞，并放入4℃冰箱内备用；进行核移植操作前20min，将制备好的供体细胞从冰箱中取出放入39℃培养箱中孵育，用移液枪吸取10μl的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，用石蜡油覆盖；3？3.？采用盲吸法为成熟卵母细胞去核，在直径100mm培养皿加入100μl显微操作液滴，再用矿物油覆盖，39℃预热后把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入显微操作液滴，然后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜上用内径20～30μm，外径120～150μm的固定吸管吸持成熟卵母细胞，用内径20～25μm的去核/注射针使第一极体处于钟表4点钟位置，并从3点钟处进针，吸取第一极体及其临近10～30％可能含有卵母细胞核的胞质；3？4.？去核的成熟卵母细胞的注核操作；在显微操作台培养皿的中央滴内置入去核的成熟卵母细胞，每次置入10～15个，培养皿中央滴周围的几个滴内置入供体细胞；首先用内径为15～20μm的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台，将去核的成熟卵母细胞置于视野下，并用...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，缪云根，逄大欣，曹晶晶，金玉兰，欧阳红生，周芳，袁婷，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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